स्वर्गीय स्टेज ड्रोसोफिला pupae के दिमाग से प्राथमिक Neuronal संस्कृति
Summary
इस वीडियो देर चरण ड्रोसोफिला pupae के दिमाग से प्राथमिक neuronal संस्कृतियों की तैयारी को दर्शाता है. जीना संस्कृतियों के दृश्य neurite और कैल्शियम Fura – 2 का उपयोग स्तर के परिणाम इमेजिंग दिखा.
Abstract
इस वीडियो में, हम देर चरण ड्रोसोफिला pupae के दिमाग से प्राथमिक neuronal संस्कृतियों की तैयारी को प्रदर्शित करता है. प्रक्रिया जानवरों से दिमाग के puparium गठन के बाद 70-78 बजे हटाने के साथ शुरू होता है. पृथक दिमाग papain में संक्षिप्त ऊष्मायन कई washes के द्वारा सीरम मुक्त मध्यम विकास में बाद के बाद दिखाया जाता है. coverslip पर मीडिया के एक 5 उल ड्रॉप में प्रत्येक मस्तिष्क के यांत्रिक पृथक्करण की प्रक्रिया सचित्र है. बाद mitotic न्यूरॉन्स के axons और dendrites से सोम निकट sheered हैं हदबंदी के दौरान, लेकिन न्यूरॉन्स चढ़ाना के कुछ ही घंटों के भीतर प्रक्रियाओं को पुनर्जीवित शुरू. छवियाँ 2 दिन पर रहते संस्कृतियों दिखा. न्यूरॉन्स संस्कृति में पहले सप्ताह के दौरान प्रक्रियाओं विस्तृत जारी है. विशिष्ट neuronal आबादी संस्कृति में पहचाना जा सकता है है GAL4 लाइनों का उपयोग करने के लिए ऊतक GFP या आरएफपी जैसे फ्लोरोसेंट मार्करों के विशिष्ट अभिव्यक्ति ड्राइव. पूरे सेल रिकॉर्डिंग प्रदर्शन किया है सभ्य न्यूरॉन्स कार्यात्मक, अनायास सक्रिय cholinergic और GABAergic synapses के रूप में. एक लघु वीडियो खंड सभ्य न्यूरॉन्स एक कैल्शियम सूचक डाई के रूप में Fura-2 का उपयोग करने के लिए सहज कैल्शियम और सभ्य न्यूरॉन्स के एक डिश में यात्रियों निकोटीन पैदा कैल्शियम प्रतिक्रियाओं की निगरानी में कैल्शियम की गतिशीलता दिखाता है. ये pupal मस्तिष्क संस्कृतियों में जो आनुवांशिक और औषधीय उपकरण आंतरिक और बाह्य कारकों है कि गठन और केंद्रीय synapses के समारोह प्रभाव की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक उपयोगी मॉडल प्रणाली रहे हैं.
Protocol
Discussion
भ्रूण / प्रसवोत्तर कृन्तकों के दिमाग से काटा न्यूरॉन्स प्राथमिक सेल संस्कृति में उगाया जा सकता है, जहां वे neurites विस्तार और कार्यात्मक synaptic कनेक्शन फार्म है. इन संस्कृतियों की तैयारी के लिए तरीके और अच्छी तरह से स…
Acknowledgements
यह काम NIH अनुदान NS27501 के द्वारा DKOD समर्थित किया गया. इस काम के लिए अतिरिक्त समर्थन DKOD HHMI प्रोफेसर कार्यक्रम के माध्यम से समर्थन में UC Irvine के लिए एक अनुदान द्वारा प्रदान की गई थी.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Concanavalin A | Sigma | C-2010 | To 2.5 ml DS, add 25 mg Concanavalin A bottle. This is 10 mg/ml concentration. Make aliquots of 90 ul and store at -20 C, no longer than 3 months. | |
| Laminin | Sigma | L-2020 | Add 1ml DS to 1mg Laminin bottle. This is 0.5 mg/ml concentration. Make aliquots of 10 ul and store at -20 C, no longer than 3 months. | |
| Coverslips | Bellco Biological Glassware | 1943-00012 | 12 mm glass coverslips | |
| ConA + Laminin solution | Stock solution, from Con A stock and laminin stock, for coverslip coating: Add in 5 ml DS, 83.5 ul of ConA (167 ug/ml) and 8.35 ul of Laminin (0.835 ug/ml). Mix. Make aliquots of 100 ul and store at -20 C, not longer than a month. | |||
| Dissecting Solution | Buffer | For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label “Dissecting Solution” and store at 4?C. | ||
| Dissecting Solution | Buffer | For 500 ml: 400 ml Ultra filtered water + 25 ml Stock Solution A + 14 ml Stock Solution B + 3.0 g (33.3 mM) D (+)-Glucose (Sigma G-8270) + 7.5 g (43.8 mM) Sucrose (Sigma S-0389). Adjust pH to 7.4 with 1N NaOH (around 2 ml). Bring final volume to 500 ml with ultra filtered water. Decant into a clean glass bottle and autoclave. Label “Dissecting Solution” and store at 4?C. | ||
| Solution B: HEPES | Buffer | Sigma | H-3375 | 20.97g (9.9mM). Add ultra filtered water up to 200 ml. Mix until dissolve and bring final volume to 250 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label “Solution B” and store at 4 C. |
| Solution A | Buffer | For 500 ml: 80.0g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4.0g (5.4mM) KCl (Sigma P-4504) + 0.24g (0.17mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0.3g (0.22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379). Weigh out all ingredients and mix until dissolved with 400 ml ultra filtered water. Bring final volume to 500 ml. Place in a clean bottle and autoclave. Label “Solution A” and store at 4°C. |
References
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