Cargo Laden op Kinesine Powered Moleculaire Shuttles
Summary
Moleculaire shuttles bestaande uit gefunctionaliseerde microtubuli glijden op het oppervlak van folie kinesine motor-eiwitten kan dienen als een nanoschaal transport systeem. Hier is de montage van een typisch shuttle systeem beschreven.
Abstract
Cellen zijn geëvolueerd geavanceerde moleculaire machines, zoals kinesine motor eiwitten en microtubuli filamenten, actief intracellulair transport van de lading te ondersteunen. Terwijl kinesins staart domein bindt aan een verscheidenheid van ladingen, kinesins hoofd domeinen maken gebruik van de chemische energie opgeslagen in ATP-moleculen te stappen langs de microtubuli rooster. De lange, stijve microtubules dienen als tracks voor de lange afstand intracellulair transport.
Deze motoren en filamenten kunnen ook worden gebruikt in microfabricated synthetische omgevingen als onderdeel van de moleculaire shuttles 1. In een vaak gebruikte design, zijn kinesine-motortjes verankerd aan het wegdek door middel van hun staart, en gefunctionaliseerde microtubules dienen als bagageruimte elementen, die worden aangedreven door deze motoren. Deze shuttles kunnen worden geladen met een lading door gebruik te maken van de sterke en selectieve binding tussen biotine en streptavidine. De belangrijkste componenten (gebiotinyleerd tubuline, streptavidine, en gebiotinyleerde lading) zijn commercieel beschikbaar.
Voortbouwend op de klassieke omgekeerde beweeglijkheid test 2, is de bouw van moleculaire shuttles hier gedetailleerd. Kinesine motor eiwitten geadsorbeerd aan een oppervlak voorgelakt met caseïne; microtubules gepolymeriseerd uit gebiotinyleerd tubuline, gehandeld op grond van de kinesine en vervolgens bedekt met rhodamine-gelabeld streptavidine. De ATP-concentratie is gehandhaafd op subsaturating concentratie om een microtubule zweefvliegen snelheid optimaal te bereiken voor het vervoer van lading 3. Tot slot, gebiotinyleerde fluoresceïne-gelabelde nanosferen worden toegevoegd als lading. Nanosferen hechten aan microtubuli als gevolg van botsingen tussen glijden microtubuli en nanosferen zich te houden aan de oppervlakte.
Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast om een verscheidenheid aan ladingen zoals gebiotinyleerd DNA-4, 5 of quantum dots een breed scala aan antigenen via gebiotinyleerde antilichamen 4-6 te laden.
Protocol
Discussion
Met kleine aanpassingen, is dit protocol met succes toegepast door een verscheidenheid van groepen om kinesine-microtubule op basis van de beweeglijkheid testen monteren. 10 mM DTT in de uiteindelijke beweeglijkheid oplossing kan worden vervangen door 0,5% β-mercapto-ethanol. Standaardoplossingen (BRB80AF, KIN20 en MT1000) meer dan 2 uur oud is mag niet gebruikt. Elke oplossing die taxol en vooral microtubuli mag nooit geplaatst worden op het ijs. Overmatige blootstelling van de stroom cel aan UV-excitatie licht result…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn een zware schuldenlast aan Jonathon Howard, wiens groep ontwikkelde de basis-protocol voor een glijdende motiliteit assay, die vervolgens werd aangepast door ons. Financiële steun van NSF te verlenen DMR0645023 is dankbaar erkend.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Adenosine-5’-triphosphate (ATP) | Invitrogen | A1049 | ||
| Biotin tubulin | Cytoskeleton Inc. | T333 | ||
| Casein | Sigma-Aldrich | C-0376 | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C-9322 | ||
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G-7528 | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8779 | ||
| Dithiotreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0610 | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | ||
| FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8766 | ||
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G-7016 | ||
| Guanosine-5’-triphosphate (GTP) | Roche Diagnostic | 106399 | ||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63069 | ||
| Paclitaxel (Taxol) | Sigma-Aldrich | T1912 | ||
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P-6757 | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P-6310 | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 480878 | ||
| Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | S11226 |
References
- Agarwal, A., Hess, H. Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science. Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).
- Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules. Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).
- Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles. Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).
- Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins. Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).
- Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins. Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).
- Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes. J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).
- Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -. Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes. Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).
- Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination. J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).
- Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -. H., Vogel, V. Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices. Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).
