Frachtladesysteme auf Kinesin Powered Molekulare Shuttles
Summary
Molekulare Shuttles, bestehend aus funktionalisierten Mikrotubuli Gleiten auf der Oberfläche haften Kinesin Motorproteine können als nanoskalige Nahverkehr dienen. Hier ist die Montage eines typischen Shuttle-System beschrieben.
Abstract
Zellen verfügen über ausgefeilte molekulare Maschinerie entwickelt, wie Kinesin Motorproteine und Mikrotubuli, zu aktiven intrazellulären Transport von Gütern zu unterstützen. Während Kinesine Schwanz Domäne bindet an eine Vielzahl von Ladungen, nutzen Kinesine Kopfdomänen die chemische Energie in ATP-Molekülen gespeichert, um entlang der Mikrotubuli Gitter Schritt. Die langen, steifen Mikrotubuli dienen als Schienen für den Fernverkehr intrazellulären Transport.
Diese Motoren und Filamente können auch in mikrofabrizierten synthetischer Umgebungen als Komponenten der molekularen Shuttles 1 eingesetzt werden. In einer häufig verwendeten Design sind Kinesin-Motoren auf die Fahrbahn durch ihre Schwänze verankert, und funktionalisierte Mikrotubuli dienen als Fracht tragenden Elemente, die von diesen Motoren angetrieben werden. Diese Shuttles können mit Ladung durch die Nutzung der starke und selektive Bindung zwischen Biotin und Streptavidin geladen werden. Die wichtigsten Komponenten (biotinylierten Tubulin, Streptavidin und biotinylierten Ladung) sind kommerziell erhältlich.
Aufbauend auf den klassischen invertierten Motilität Test 2 ist der Aufbau von molekularen Shuttles detaillierte hier. Kinesin Motorproteine sind an einer Oberfläche mit Kasein vorbeschichtet adsorbiert; Mikrotubuli sind aus biotinylierten Tubulin polymerisiert, haftete an der Kinesin und anschließend mit Rhodamin-markiertem Streptavidin beschichtet. Die ATP-Konzentration ist bei subsaturating Konzentration aufrechterhalten, um ein Mikrotubulus Gleiten Geschwindigkeit optimal für Beladen 3 zu erreichen. Schließlich biotinylierten fluoresceinmarkierten Nanokügelchen als Fracht aufgenommen. Nanospheres an Mikrotubuli legen als Resultat von Kollisionen zwischen Gleiten Mikrotubuli und Nanokügelchen an der Oberfläche haften.
Das Protokoll kann leicht modifiziert werden, um eine Vielzahl von Ladungen wie biotinylierten DNA 4, Quantenpunkte 5 oder eine Vielzahl von Antigenen über biotinylierte Antikörper 4-6 laden.
Protocol
Discussion
Mit geringfügigen Änderungen wurde das Protokoll erfolgreich von einer Vielzahl von Gruppen verwendet werden, um Kinesin-Mikrotubuli-basierte Motilität Assays zu montieren. 10 mM DTT in den letzten Motilität Lösung kann mit 0,5% β-Mercaptoethanol ersetzt werden. Standard-Lösungen (BRB80AF, KIN20 und MT1000) mehr als 2 Stunden alt sollte nicht verwendet werden. Jede Lösung enthält Taxol und insbesondere Mikrotubuli sollte niemals auf Eis gelegt werden. Übermäßige Exposition der Messzelle gegen UV-Anregungslic…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind hoch verschuldet, um Jonathon Howard, dessen Gruppe entwickelte das grundlegende Protokoll für eine gleitende Beweglichkeit Assay, der anschließend von uns angepasst wurde. Finanzielle Unterstützung von NSF gewähren DMR0645023 gedankt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Adenosine-5’-triphosphate (ATP) | Invitrogen | A1049 | ||
| Biotin tubulin | Cytoskeleton Inc. | T333 | ||
| Casein | Sigma-Aldrich | C-0376 | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C-9322 | ||
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G-7528 | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8779 | ||
| Dithiotreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0610 | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | ||
| FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8766 | ||
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G-7016 | ||
| Guanosine-5’-triphosphate (GTP) | Roche Diagnostic | 106399 | ||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63069 | ||
| Paclitaxel (Taxol) | Sigma-Aldrich | T1912 | ||
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P-6757 | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P-6310 | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 480878 | ||
| Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | S11226 |
References
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