ההסעות מולקולרית המורכבת microtubules פונקציונליות מחליק על פני השטח, דבק kinesin חלבונים המנוע יכול לשמש כמערכת הובלה הננומטרי. הנה, הרכבה של מערכת הסעה טיפוסית מתואר.
תאים התפתחו מכונות מולקולריות מתוחכמות, כגון חלבונים kinesin המנוע חוטים microtubule, לתמוך תחבורה תאיים פעיל של המטען. בעוד kinesins זנב תחום נקשר מגוון רחב של מטענים, kinesins תחומים הראש לנצל את האנרגיה הכימית מאוחסנים מולקולות ATP לשלב יחד הסריג microtubule. ארוך, microtubules נוקשה לשמש להובלת מסלולים למרחקים ארוכים תאיים.
מנועים אלה סיבים יכולים גם להיות מועסק בסביבות סינתטי microfabricated כרכיבים של המעבורות מולקולרית 1. בעיצוב נעשה שימוש תכוף, kinesin מנועים מעוגנים אל פני השטח את המסלול דרך הזנבות שלהם, microtubules פונקציונליות לשמש מרכיבים המטען שנשאו, אשר מונע על ידי מנועים אלה. בהסעות אלה ניתן לטעון עם מטען על ידי ניצול מחייב חזק סלקטיבית בין ביוטין ו streptavidin. מרכיבי מפתח (טובולין biotinylated, streptavidin, ומטענים biotinylated) זמינים מסחרית.
בונים על assay תנועתיות הקלאסי הפוכה 2, בנייה של המעבורות מולקולרי מפורט כאן. Kinesin חלבוני מנוע הם adsorbed על משטח precoated עם קזאין; microtubules הם polymerized של טובולין biotinylated, דבק kinesin ומצופה לאחר מכן עם streptavidin-rhodamine שכותרתו. ריכוז ה-ATP נשמר ריכוז subsaturating להשיג מהירות microtubule גלישה אופטימלית עבור טעינת מטען 3. לבסוף, biotinylated והעמסת שכותרתו nanospheres מתווספים כמו מטען. Nanospheres לצרף microtubules כתוצאה מהתנגשויות בין microtubules גלישה ו nanospheres שמירה על פני השטח.
הפרוטוקול ניתן לשנות בקלות לטעון מגוון רחב של מטענים כגון DNA biotinylated 4, 5 נקודות קוונטיות או מגוון רחב של אנטיגנים באמצעות נוגדנים biotinylated 4-6.
עם שינויים קלים, פרוטוקול זה שימש בהצלחה על ידי מגוון של קבוצות להרכיב kinesin-microtubule מבחני תנועתיות מבוסס. DTT 10 מ"מ הפתרון הסופי תנועתיות יכול להיות מוחלף עם 0.5% β-mercaptoethanol. תקן פתרונות (BRB80AF, KIN20 ו MT1000) יותר מ 2 שעות הישן לא צריך להשתמש. כל פתרון המכיל microtubules טקסול ובמיוחד ל…
The authors have nothing to disclose.
אנחנו אסירי תודה בכבדות אל יונתן הווארד, אשר פיתח את הקבוצה פרוטוקול בסיסי assay תנועתיות גלישה אשר הותאמה לאחר מכן על ידי בנו. תמיכה כספית מן NSF מענק DMR0645023 היא הודתה בהכרת תודה.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Adenosine-5’-triphosphate (ATP) | Invitrogen | A1049 | ||
Biotin tubulin | Cytoskeleton Inc. | T333 | ||
Casein | Sigma-Aldrich | C-0376 | ||
Catalase | Sigma-Aldrich | C-9322 | ||
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G-7528 | ||
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8779 | ||
Dithiotreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0610 | ||
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | ||
FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8766 | ||
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G-7016 | ||
Guanosine-5’-triphosphate (GTP) | Roche Diagnostic | 106399 | ||
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63069 | ||
Paclitaxel (Taxol) | Sigma-Aldrich | T1912 | ||
1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P-6757 | ||
Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P-6310 | ||
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 480878 | ||
Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | S11226 |