Kinesin संचालित आण्विक शटल पर कार्गो लोड हो रहा है
Summary
आण्विक शटल functionalized सतह पालन kinesin मोटर प्रोटीन nanoscale एक परिवहन प्रणाली के रूप में सेवा कर सकते हैं पर ग्लाइडिंग सूक्ष्मनलिकाएं से मिलकर. यहाँ एक ठेठ शटल प्रणाली की विधानसभा में वर्णित है.
Abstract
कक्ष परिष्कृत आणविक मशीनरी विकसित किया है, जैसे kinesin मोटर प्रोटीन और microtubule filaments के लिए माल की सक्रिय intracellular परिवहन का समर्थन. जबकि kinesins पूंछ डोमेन कार्गो की एक किस्म के लिए बांधता है, kinesins सिर डोमेन रासायनिक एटीपी अणुओं में संग्रहीत करने के लिए microtubule जाली साथ कदम ऊर्जा का उपयोग. लंबे, कठोर सूक्ष्मनलिकाएं लंबी दूरी intracellular परिवहन के लिए पटरियों के रूप में में सेवा करते हैं.
ये मोटर्स और filaments microfabricated कृत्रिम वातावरण में भी आणविक एक शटल के घटक के रूप में नियोजित किया जा सकता है . एक बार इस्तेमाल किया डिजाइन में, kinesin मोटर्स उनके पूंछ के माध्यम से ट्रैक की सतह के लिए anchored रहे हैं, और functionalized सूक्ष्मनलिकाएं माल ले जाने के तत्वों, जो इन मोटर्स द्वारा चालित हैं के रूप में सेवा करते हैं. इन शटल बायोटिन और streptavidin के बीच मजबूत और चयनात्मक बंधन का उपयोग करके माल के साथ लोड किया जा सकता है. प्रमुख घटक (biotinylated ट्यूबिलिन, streptavidin और biotinylated कार्गो) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं.
क्लासिक उल्टे गतिशीलता परख 2 पर बिल्डिंग, आणविक शटल के निर्माण यहाँ विस्तृत है. Kinesin मोटर प्रोटीन कैसिइन के साथ Precoated सतह adsorbed, सूक्ष्मनलिकाएं biotinylated ट्यूबिलिन से polymerized हैं, kinesin के लिए पालन और बाद में rhodamine लेबल streptavidin के साथ लेपित हैं. 3 माल लदान के लिए एक microtubule ग्लाइडिंग इष्टतम वेग प्राप्त करने के एटीपी एकाग्रता subsaturating एकाग्रता पर बनाए रखा है. अंत में biotinylated, fluorescein लेबल nanospheres माल के रूप में जोड़ रहे हैं. Nanospheres ग्लाइडिंग सूक्ष्मनलिकाएं और nanospheres सतह का पालन करने के बीच collisions का एक परिणाम के के रूप में सूक्ष्मनलिकाएं को देते हैं.
प्रोटोकॉल करने के लिए आसानी से किया जा biotinylated डीएनए 4, क्वांटम 5 डॉट्स या biotinylated 4-6 एंटीबॉडी के माध्यम से प्रतिजनों की एक विस्तृत विविधता जैसे कार्गो की एक किस्म को लोड करने के लिए संशोधित कर सकते हैं.
Protocol
Discussion
मामूली संशोधनों के साथ, इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक किया गया है समूहों की एक किस्म के द्वारा इस्तेमाल किया kinesin microtubule आधारित गतिशीलता assays इकट्ठा. अंतिम गतिशीलता समाधान में 10 मिमी डीटीटी 0.5% β-mercaptoethanol के साथ प्?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम भारी Jonathon हावर्ड, जिसका समूह एक ग्लाइडिंग गतिशीलता परख जो बाद में हमारे द्वारा रूपांतरित किया गया के लिए बुनियादी प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए ऋणी हैं. NSF अनुदान DMR0645023 से वित्तीय सहायता आभार स्वीकार किया है.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Adenosine-5’-triphosphate (ATP) | Invitrogen | A1049 | ||
| Biotin tubulin | Cytoskeleton Inc. | T333 | ||
| Casein | Sigma-Aldrich | C-0376 | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C-9322 | ||
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G-7528 | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8779 | ||
| Dithiotreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0610 | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | ||
| FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8766 | ||
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G-7016 | ||
| Guanosine-5’-triphosphate (GTP) | Roche Diagnostic | 106399 | ||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63069 | ||
| Paclitaxel (Taxol) | Sigma-Aldrich | T1912 | ||
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P-6757 | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P-6310 | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 480878 | ||
| Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | S11226 |
References
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