Embarque de carga para cinesina Produzido Shuttles Molecular
Summary
Shuttles molecular composta por microtúbulos funcionalizados deslizando na superfície, aderiram proteínas cinesina motor pode servir como um sistema de transporte em nanoescala. Aqui, a montagem de um sistema de transporte típico é descrito.
Abstract
As células se desenvolveram máquinas moleculares sofisticadas, tais como proteínas cinesina motor e filamentos de microtúbulos, para apoiar o transporte intracelular ativa da carga. Enquanto kinesins cauda domínio liga-se a uma variedade de cargas, domínios kinesins cabeça utilizar a energia química armazenada em moléculas de ATP para a etapa ao longo da rede de microtúbulos. A longa e dura microtúbulos servem como pistas para transporte de longa distância intracelular.
Estes motores e filamentos também podem ser empregadas em ambientes sintéticos microfabricated como componentes de ônibus molecular 1. Em um design freqüentemente usados, motores de cinesina estão ancorados à superfície da pista através de suas caudas, e microtúbulos funcionalizados servir como elementos de carga de transporte, que são impulsionadas por esses motores. Estas naves podem ser carregados com a carga, utilizando a ligação forte e seletiva entre biotina e estreptavidina. Os componentes-chave (tubulina biotinilado, estreptavidina e carga biotinilado) estão disponíveis comercialmente.
Baseando-se no ensaio de motilidade clássico invertido 2, a construção de naves molecular é detalhado aqui. Proteínas cinesina motor são adsorvidas a uma superfície previamente revestidas com caseína; microtúbulos são polimerizados da tubulina biotinilado, aderiu ao cinesina e posteriormente revestido com rodamina-rotulados estreptavidina. A concentração de ATP é mantida a concentração subsaturating para alcançar uma velocidade de deslizamento dos microtúbulos ideal para o carregamento de carga 3. Finalmente, biotinilado fluoresceína marcado nanoesferas são adicionadas como carga. Nanoesferas anexar aos microtúbulos, como resultado de colisões entre microtúbulos delta e nanoesferas de aderir à superfície.
O protocolo pode ser facilmente modificado para carregar uma variedade de mercadorias como o DNA biotinilado 4, 5 ou pontos quânticos de uma grande variedade de antígenos através de anticorpos biotinilados 4-6.
Protocol
Discussion
Com pequenas modificações, este protocolo tem sido usado com sucesso por uma variedade de grupos para montar kinesin microtúbulos ensaios motilidade base. 10 mM DTT na solução motilidade final pode ser substituído por 0,5% β-mercaptoetanol. Soluções padrão (BRB80AF, KIN20 e MT1000) mais de 2 horas de idade não deve ser utilizado. Qualquer solução contendo microtúbulos taxol e, especialmente, nunca deve ser colocado no gelo. Exposição excessiva da célula de fluxo com os resultados de excitação de luz U…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos endividados para Jonathon Howard, cujo grupo desenvolveu o protocolo básico para um ensaio da motilidade delta que foi posteriormente adaptado por nós. Apoio financeiro da concessão do NSF DMR0645023 é reconhecido agradecimento.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Adenosine-5’-triphosphate (ATP) | Invitrogen | A1049 | ||
| Biotin tubulin | Cytoskeleton Inc. | T333 | ||
| Casein | Sigma-Aldrich | C-0376 | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C-9322 | ||
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G-7528 | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8779 | ||
| Dithiotreitol (DTT) | Bio-Rad | 161-0610 | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E-4378 | ||
| FluoSpheres Biotinylated microspheres, 40 nm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F-8766 | ||
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G-7016 | ||
| Guanosine-5’-triphosphate (GTP) | Roche Diagnostic | 106399 | ||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 63069 | ||
| Paclitaxel (Taxol) | Sigma-Aldrich | T1912 | ||
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid, Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid), Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P-6757 | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P-6310 | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 480878 | ||
| Streptavidin Alexa Fluor 568 conjugate | Invitrogen | S11226 |
References
- Agarwal, A., Hess, H. Biomolecular motors at the intersection of nanotechnology and polymer science. Progress in Polymer Science. 35 (1-2), 252-252 (2010).
- Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules. Methods Cell Biol. 39, 137-137 (1993).
- Agarwal, A., Katira, P., Hess, H. Millisecond curing time of a molecular adhesive causes velocity-dependent cargo-loading of molecular shuttles. Nano Lett. 9 (3), 1170-1170 (2009).
- Diez, S., Reuther, C., Dinu, C., Seidel, R., Mertig, M., Pompe, W., Howard, J. Stretching and Transporting DNA Molecules Using Motor Proteins. Nano Lett. 3 (9), 1251-1251 (2003).
- Bachand, G. D., Rivera, S. B., Boal, A. K., Gaudioso, J., Liu, J., Bunker, B. C. Assembly and transport of nanocrystal CdSe quantum dot nanocomposites using microtubules and kinesin motor proteins. Nano Lett. 4 (5), 817-817 (2004).
- Coy, D. L., Wagenbach, M., Howard, J. Kinesin takes one 8-nm step for each ATP that it hydrolyzes. J. Biol. Chem. 274 (6), 3667-3667 (1999).
- Katira, P., Agarwal, A., Fischer, T., Chen, H. -. Y., Jiang, X., Lahann, J., Hess, H. Quantifying the performance of protein-resisting surfaces at ultra-low protein coverages using kinesin motor proteins as probes. Advanced Materials. 19, 3171-3171 (2007).
- Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination. J. Cell Biol. 107, 1011-1011 (1988).
- Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -. H., Vogel, V. Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices. Nanotechnology. 15 (10), S540-S540 (2004).
