宏基因组库的大型屏幕

Abstract

宏基因组库存档的连续，而无需事先培养的微生物基因组序列的大片段。生成一个简化程序，用于创建和筛选宏基因组库，因此可用于高效高通量为未培养微生物组合的遗传和代谢性质的调查。在这里，关键协议的视频，这是我们提出的是最有用的格式，为准确地描述一个长期的过程，交替取决于机器人仪器和（人类）人工干预。首先，我们采用机器人当场库中克隆到高密度macroarray膜，每一个都可以从二十四384库板包含重复的殖民地。自动化是至关重要，这不仅对精度和速度的程序，但也由于规模，以适应高密度的空间安排大量的库克隆小型化。一旦产生，接下来我们演示了如何macroarray膜可用于使用探针标记，杂交膜，和信号检测的标准协议修改后的版本利益的基因筛选。我们补充了这些程序的详细的书面说明所涉及的步骤和所需材料，所有这一切都是在网上提供视频一起的视觉示范。

Protocol

1。杂交过程一个杂交管会采取1或2的膜（22厘米大小22）。使用杂交液50毫升和0.5毫克每杂交管的DNA探针（10 ng / ml的终浓度）。为了达到最佳效果，请使用凝胶纯化的DNA为探针。如果缩放了探针的制备，管数量的增加，而不是增加每管中的试剂量。 探针制备（0.5毫克DNA）： 60μL水稀释15μL交联剂的解决方案。 稀的DNA为10 ng /μL水，一个螺丝帽?…

Discussion

剥离的过程并没有得到优化。然而，在剥离过程中制造商的指示（2洗，100％的乙醇10分钟，1小时1洗在60 ° C的0.5％SDS）是不够的。孵育过夜至少在100％的乙醇是必要的，解散的ECF反应产物;几天出现在100％的乙醇孵化有能力重新探测膜没有不利的影响。制造商的SDS治疗也似乎是不够的。 NUF已试图在1小时80 ° C，0.5％SDS近沸腾的0.1％SDS成功治疗。麦蒂已经浇过近沸的0.1％SDS，一次就足够了。

帮助提示：
杂…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
AlkPhos Direct Labelling Reagents	kit	Amersham	RPN3680	Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C.
ECF Substrate	kit	Amersham	RPN3685	Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer. Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm).
20x Secondary Wash Buffer	buffer			121 g Tris (final 1 M), 117 g NaCl (final 2 M). Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months.
0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7	buffer			69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature.
1 M MgCl2				50.8 g MgCl2.6H2O Adjust to 250 ml with water. Store at room temperature.
10% (w/v) SDS				20 g SDS Adjust to 200 ml with water. Store at room temperatur

Combination pack RPN3692 = RPN3680 + RPN3685