Large-Scale-Bildschirme von Metagenombanken
Abstract
Metagenombanken Archivierung großer Fragmente des angrenzenden genomischen Sequenzen von Mikroorganismen ohne vorherige Kultivierung. Erstellen eines vereinfachten Verfahrens für die Erstellung und Screening Metagenombanken ist daher für eine effiziente Hochdurchsatz-Untersuchungen der genetischen und metabolischen Eigenschaften von unkultivierten Mikroorganismen Assemblagen nützlich. Hier werden die wichtigsten Protokolle auf Video, was wir vorschlagen, ist die nützlichste Format für die genaue Beschreibung eines langen Prozesses, der abwechselnd hängt von Roboter-Instrumenten und (menschlichen) manuelle Eingriffe vorgestellt. Zunächst beschäftigten wir Robotik bis zur Bibliothek Klone auf High-Density-Makroarray Membranen, von denen jedes Duplikat Kolonien 20-4 384-well Platten-Bibliothek enthalten kann vor Ort. Automation ist für dieses Verfahren nicht nur für die Genauigkeit und Geschwindigkeit, sondern auch aufgrund der Miniaturisierung der Maßstab erforderlich, um die große Anzahl von Bibliotheks-Klone in sehr dichten räumlichen Anordnungen fit. Einmal erstellt, wir als nächstes gezeigt, wie die Makroarray Membranen für Gene von Interesse unter Verwendung von modifizierten Versionen der Standard-Protokolle für Sondenmarkierung, Membran-Hybridisierung und Signalerkennung gescreent werden können. Wir ergänzten die bildliche Darstellung dieser Verfahren mit ausführlichen schriftlichen Beschreibungen der einzelnen Schritte und die benötigten Materialien, die alle online verfügbar neben dem Video sind.
Protocol
Discussion
Das Strippen Verfahren nicht optimiert wurde. Allerdings ist das Stripping in der Anleitung des Herstellers (2 Wäschen je 10 min in 100% Ethanol, 1 Wäsche von 1 h bei 60 ° C in 0,5% SDS) gegeben unzureichend. Mindestens Inkubation über Nacht in 100% Ethanol ist notwendig, um den ECF Reaktionsprodukt aufzulösen; mehreren Tagen Inkubation in 100% Ethanol scheint keine negativen Auswirkungen auf die Fähigkeit der Membran reprobe haben. Die vom Hersteller SDS-Behandlung scheint auch nicht ausreichen. NUF hat 1 h bei 80 ° C versuchte mit …
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| AlkPhos Direct Labelling Reagents | kit | Amersham | RPN3680 | Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C. |
| ECF Substrate | kit | Amersham | RPN3685 | Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer. Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm). |
| 20x Secondary Wash Buffer | buffer | 121 g Tris (final 1 M), 117 g NaCl (final 2 M). Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months. | ||
| 0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7 | buffer | 69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature. | ||
| 1 M MgCl2 | 50.8 g MgCl2.6H2O Adjust to 250 ml with water. Store at room temperature. | |||
| 10% (w/v) SDS | 20 g SDS Adjust to 200 ml with water. Store at room temperatur |
