Metagenomic पुस्तकालय के बड़े पैमाने पर स्क्रीन
Abstract
पूर्व खेती की आवश्यकता के बिना सूक्ष्मजीवों से सटे जीनोमिक दृश्यों के Metagenomic पुस्तकालयों संग्रह के बड़े टुकड़े. बनाने और स्क्रीनिंग metagenomic पुस्तकालयों के लिए एक सुव्यवस्थित प्रक्रिया उत्पन्न इसलिए असभ्य माइक्रोबियल assemblages के आनुवांशिक और चयापचय गुणों में कुशल उच्च throughput जांच के लिए उपयोगी है. यहाँ कुंजी प्रोटोकॉल वीडियो है, जो हम सही एक लंबी प्रक्रिया है कि एकांतर रोबोट इंस्ट्रूमेंटेशन और (मानव) मैनुअल हस्तक्षेप पर निर्भर करता है का वर्णन करने के लिए सबसे उपयोगी प्रारूप प्रस्ताव है पर प्रस्तुत कर रहे हैं. सबसे पहले, हम रोबोटिक्स रोजगार के लिए उच्च घनत्व macroarray झिल्ली पर पुस्तकालय क्लोन, जिनमें से प्रत्येक चौबीस 384 अच्छी तरह से पुस्तकालय प्लेटें से डुप्लिकेट कालोनियों को शामिल कर सकते हैं हाजिर. स्वचालन सटीकता और गति के लिए ही नहीं इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक है, लेकिन यह भी पुस्तकालय क्लोनों की एक बड़ी संख्या अत्यधिक घने स्थानिक व्यवस्था में फिट करने के लिए आवश्यक पैमाने के miniaturization के कारण. एक बार उत्पन्न, हम अगले दिखा दिया कैसे macroarray झिल्ली ब्याज की जांच लेबलिंग, झिल्ली संकरण, और संकेत का पता लगाने के लिए मानक प्रोटोकॉल का संशोधित संस्करण का उपयोग जीन के लिए जांच की जा सकती है. हम शामिल कदम की विस्तृत लिखित विवरण और आवश्यक सामग्री है, जो सभी के वीडियो उपलब्ध ऑनलाइन के साथ कर रहे हैं के साथ इन प्रक्रियाओं के दृश्य प्रदर्शन पूरित.
Protocol
Discussion
विपठ्ठन प्रक्रिया अनुकूलित नहीं किया गया है. हालांकि, विपठ्ठन निर्माता के अनुदेश (2 प्रत्येक washes, 100% इथेनॉल में 10 मिनट, 60 एसडीएस डिग्री सेल्सियस 0.5% में 1 1 ज धोने) में दी गई प्रक्रिया अपर्याप्त है. कम से कम 100% इथेनॉल मे?…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| AlkPhos Direct Labelling Reagents | kit | Amersham | RPN3680 | Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C. |
| ECF Substrate | kit | Amersham | RPN3685 | Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer. Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm). |
| 20x Secondary Wash Buffer | buffer | 121 g Tris (final 1 M), 117 g NaCl (final 2 M). Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months. | ||
| 0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7 | buffer | 69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature. | ||
| 1 M MgCl2 | 50.8 g MgCl2.6H2O Adjust to 250 ml with water. Store at room temperature. | |||
| 10% (w/v) SDS | 20 g SDS Adjust to 200 ml with water. Store at room temperatur |
