メタゲノムライブラリの大規模スクリーン
Abstract
前の栽培を必要とせずに微生物から連続したゲノム配列のメタゲノムライブラリのアーカイブ大きい断片。メタゲノムライブラリーを作成し、スクリーニングするための合理化された手順を生成すると、未培養微生物群集の遺伝的および代謝特性に効率的な高スループットの調査に有用である。ここでは、主要なプロトコルは、我々は正確に交互にロボットの計測と（人間の）手動の介入に依存する長いプロセスを記述するための最も有用なフォーマットである提案するビデオ、上に表示されています。最初に、我々は、24 384ライブラリのプレートから重複したコロニーを含むことができるそれぞれの高密度マクロアレイメンブレン上にライブラリークローンを、見つけるためにロボットを採用。オートメーションは、高密度の空間的配置にライブラリークローンの大規模な数に合わせて必要な規模の小型化のためだけでなく、精度と速度のため、この手順が不可欠ですが、。一度生成された、我々は次のマクロアレイメンブレンは、プローブのラベリング、メンブレンハイブリダイゼーション、およびシグナル検出のための標準プロトコルの修正バージョンを使用して、目的の遺伝子をスクリーニングすることができる方法を示しました。我々は、ビデオと一緒にオンラインで利用可能なすべてが詳細に書かれた必要な手順の説明と必要な材料、これらの手順の視覚的なデモンストレーションを補完。
Protocol
Discussion
ストリッピングの手順が最適化されていません。しかし、メーカーの指示（2回洗浄それぞれ、100％エタノールで10分間、60℃0.5％SDSで1時間の1洗浄）で与えられるストリッピングの手順は不十分です。 100％エタノールで少なくとも一晩のインキュベーションでは、ECFの反応生成物を溶解するために必要であり、100％エタノールで数日のインキュベーションでは、メンブレンをリプローブする能力に悪影響が?…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| AlkPhos Direct Labelling Reagents | kit | Amersham | RPN3680 | Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C. |
| ECF Substrate | kit | Amersham | RPN3685 | Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer. Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm). |
| 20x Secondary Wash Buffer | buffer | 121 g Tris (final 1 M), 117 g NaCl (final 2 M). Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months. | ||
| 0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7 | buffer | 69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature. | ||
| 1 M MgCl2 | 50.8 g MgCl2.6H2O Adjust to 250 ml with water. Store at room temperature. | |||
| 10% (w/v) SDS | 20 g SDS Adjust to 200 ml with water. Store at room temperatur |
