Metagenomic bibliotecas fragmentos contíguos grande arquivo de seqüências genômicas de microrganismos de cultivo sem a necessidade de prévio. Gerando um procedimento simplificado para a criação de bibliotecas e triagem metagenomic é, portanto, útil para eficiente de alto rendimento investigações sobre as propriedades genéticas e metabólicas dos agenciamentos microbiana inculta. Aqui, protocolos de chave são apresentados em vídeo, o que propomos é o formato mais útil para descrever com precisão um longo processo que depende alternadamente instrumentação robótica e intervenções (humano) manual. Primeiro, nós empregada robótica para detectar clones biblioteca para as membranas de alta densidade macroarray, cada um dos quais pode conter colônias duplicar 20-4 biblioteca placas de 384 poços. Automação é essencial para este procedimento não só quanto à precisão e velocidade, mas também devido à miniaturização de escala necessária para atender o grande número de clones de biblioteca em alta densidade arranjos espaciais. Uma vez gerado, o próximo demonstrou como as membranas macroarray podem ser selecionados para genes de interesse usando versões modificadas de protocolos padrão para rotulagem sonda, hibridação da membrana e detecção do sinal. Complementou-se o demonstração visual desses procedimentos com descrição escrita pormenorizada das etapas envolvidas e os materiais necessários, os quais estão disponíveis on-line ao lado do vídeo.
Protocol
1. Processo de hibridização Um tubo de hibridização terá 1 ou 2 membranas (tamanho 22 por 22 cm). Use 50 ml de mistura de hibridização e 0,5 mg de DNA sonda (10 concentração ng / ml final) por tubo de hibridização. Para melhores resultados, use gel de DNA purificado como sonda. Se ampliação preparação da sonda, aumentar o número de tubos em vez de aumentar a quantidade de reagentes por tubo. Sonda preparação (0,5 mg DNA): Diluir 15 mL de…
Discussion
O procedimento de stripping não foi otimizado. No entanto, o procedimento de stripping dada na instrução do fabricante (2 lavagens cada uma, 10 min em etanol 100%, uma lavagem de 1 hora a 60 ° C em 0,5% SDS) é insuficiente. Pelo menos de incubação durante a noite em etanol a 100% é necessário para dissolver o produto da reação ECF; de incubação de vários dias em etanol 100% parece não ter efeitos adversos sobre a capacidade de reprobe da membrana. Tratamento do fabricante SDS também parece ser insuficiente. NUF tentou 1 hora…
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
AlkPhos Direct Labelling Reagents
kit
Amersham
RPN3680
Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C.
ECF Substrate
kit
Amersham
RPN3685
Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer.
Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm).
20x Secondary Wash Buffer
buffer
121 g Tris (final 1 M),
117 g NaCl (final 2 M).
Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months.
0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7
buffer
69 g NaH2PO4.H2O.
Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature.
1 M MgCl2
50.8 g MgCl2.6H2O
Adjust to 250 ml with water. Store at room temperature.
10% (w/v) SDS
20 g SDS
Adjust to 200 ml with water. Store at room temperatur