Grands écrans des banques métagénomiques

Résumé

Métagénomique fragments bibliothèques grande archive de séquences génomiques contiguës à partir de microorganismes sans nécessiter de culture préalable. Génération d'une procédure simplifiée pour la création et le criblage de métagénomique est donc utile pour l'efficacité à haut débit des enquêtes sur les propriétés génétiques et métaboliques des assemblages microbiens incultes. Ici, les protocoles clés sont présentés sur vidéo, que nous proposons est le format le plus utile pour décrire avec précision un long processus qui dépend alternativement sur l'instrumentation et les interventions manuelles robotisées (humain). Premièrement, nous avons utilisé la robotique de repérer les clones de bibliothèques sur des membranes macroarray haute densité, dont chacune peut contenir des colonies reproduire vingt à quatre plaques bibliothèque de 384 puits. L'automatisation est essentielle pour cette procédure non seulement pour la précision et la vitesse, mais aussi en raison de la miniaturisation d'échelle nécessaires pour s'adapter au grand nombre de clones de la banque en très dense arrangements spatiaux. Une fois produite, nous avons ensuite montré comment les membranes macroarray peuvent être criblés pour des gènes d'intérêt en utilisant des versions modifiées des protocoles standard pour l'étiquetage de sonde, l'hybridation membrane, et la détection du signal. Nous avons complété la démonstration visuelle de ces procédures avec des descriptions détaillées écrite des étapes et le matériel requis, qui sont tous disponibles en ligne aux côtés de la vidéo.

Protocole

1. Procédure d'hybridation

Un tube d'hybridation aura 1 ou 2 membranes (taille 22 par 22 cm). Utilisez 50 ml de mélange d'hybridation et de 0,5 mg d'ADN de la sonde (10 ng / ml de concentration finale) par tube d'hybridation. Pour de meilleurs résultats, utilisez un gel ADN purifié comme sonde. Si l'échelle jusqu'à la préparation de sonde, d'augmenter le nombre de tubes plutôt que d'augmenter la quantité de réactifs par tube.

Sonde de préparation (0,5 mg ADN):

1. Diluer 15 pi de cross-linker solution avec 60 pl d'eau.
2. Diluer l'ADN à 10 ng / ul avec de ....

Discussion

La procédure de dépouillement n'a pas été optimisée. Toutefois, la procédure de décapage donné dans les instructions du fabricant (2 lavages chacun, 10 min dans de l'éthanol à 100%, 1 lavage de 1 h à 60 ° C dans du SDS 0,5%) est insuffisant. Au moins une nuit d'incubation dans de l'éthanol à 100% est nécessaire pour dissoudre le produit de la réaction ECF, plusieurs jours d'incubation dans de l'éthanol à 100% ne semble pas avoir d'effets néfastes sur l'aptitude à reprobe la membrane. Le fabricant du traitemen.......

Matériaux

Combinaison sac RPN3692 = RPN3680 + RPN3685