Крупномасштабная Экраны метагеномных библиотеки
Abstract
Метагеномных архива библиотеки крупных фрагментов смежных геномных последовательностей из микроорганизмов, не требуя предварительного культивирования. Создание упрощенной процедуре для создания и проверки метагеномных библиотек поэтому полезен для эффективного высокопроизводительного расследования генетических и метаболических свойств некультурных комплексов микроорганизмов. Здесь основные протоколы представлены на видео, которое мы предлагаем, является наиболее полезным форматом для точного описания длительный процесс, который попеременно зависит от роботов приборов и (человеческого) вмешательства руководства. Во-первых, мы использовали робототехники обнаружить библиотеку клонов на высокой плотности мембран macroarray, каждый из которых может содержать повторяющиеся колоний от двадцати четырех 384-луночных библиотеки. Автоматизация имеет важное значение для этой процедуры не только точность и скорость, но и за счет миниатюризации масштабах, необходимых, чтобы соответствовать большое количество клонов в библиотеке высокой плотности пространственных механизмов. После генерируется, мы в следующий раз продемонстрировал, как macroarray мембраны могут пройти обследование на гены интереса с использованием модифицированной версии стандартных протоколов для зонда маркировки, мембранные гибридизация и обнаружения сигнала. Мы дополняли наглядной демонстрации этих процедур с подробного письменного описания этапов и материалов, необходимых, все из которых доступны в Интернете вместе с видео.
Protocol
Discussion
Зачистки процедура не была оптимизирована. Тем не менее, зачистки процедурой, приведенной в инструкции производителя (2 моет каждый, 10 мин в 100% этанол, 1 мыть 1 ч при 60 ° С в 0,5% SDS) является недостаточной. По крайней мере инкубации в течение ночи в 100% этанола необходимо растворить продукт ECF реакции; нес…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| AlkPhos Direct Labelling Reagents | kit | Amersham | RPN3680 | Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C. |
| ECF Substrate | kit | Amersham | RPN3685 | Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer. Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm). |
| 20x Secondary Wash Buffer | buffer | 121 g Tris (final 1 M), 117 g NaCl (final 2 M). Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months. | ||
| 0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7 | buffer | 69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature. | ||
| 1 M MgCl2 | 50.8 g MgCl2.6H2O Adjust to 250 ml with water. Store at room temperature. | |||
| 10% (w/v) SDS | 20 g SDS Adjust to 200 ml with water. Store at room temperatur |
