Storskaliga skärmar Metagenomic bibliotek
Abstract
Metagenomic bibliotek arkivera stora fragment av sammanhängande genomisk sekvenser från mikroorganismer utan föregående odling. Generera ett standardförfarande för att skapa och screening metagenomic biblioteken är därför lämpligt för effektiv hög genomströmning undersökningar av genetiska och metaboliska egenskaper okultiverade mikrobiell konstellationer. Här är viktiga protokoll presenteras på video, som vi föreslår är den mest användbara format för exakt beskriva en lång process som växelvis beroende av robotar instrumentering och (mänskliga) ingrepp manual. Först anställde vi robotik att upptäcka biblioteket kloner på hög densitet macroarray membran, som alla kan innehålla dubbletter kolonier 20-4 384-såväl bibliotek plattor. Automation är nödvändigt för detta förfarande inte bara för noggrannhet och hastighet, men också på grund av miniatyrisering av omfattning som krävs för att passa det stora antalet bibliotek kloner till mycket tät rumsliga arrangemang. När genererade visade vi nästa hur macroarray membranen kan screenas för gener av intresse att använda modifierade versioner av standardprotokoll för givare märkning, membran hybridisering, och signal upptäckt. Vi kompletterade den visuella demonstration av dessa förfaranden med detaljerade skriftliga beskrivningar av de inblandade steg och nödvändigt material, som alla finns tillgängliga online tillsammans med video.
Protocol
Discussion
Det strippa förfarandet inte har optimerats. Dock är strippa förfarande som anges i tillverkarens anvisningar (2 tvättar vardera 10 min i 100% etanol, 1 tvätta av 1 h vid 60 ° C i 0,5% SDS) otillräcklig. Åtminstone natten inkubation i 100% etanol är nödvändigt för att lösa upp produkten ECF reaktionen, flera dagars inkubation i 100% etanol verkar ha några negativa effekter på förmågan att reprobe membranet. Tillverkarens SDS behandling verkar också vara otillräcklig. NUF har försökt 1 timme vid 80 ° C med 0,5% SDS föl…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| AlkPhos Direct Labelling Reagents | kit | Amersham | RPN3680 | Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C. |
| ECF Substrate | kit | Amersham | RPN3685 | Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer. Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm). |
| 20x Secondary Wash Buffer | buffer | 121 g Tris (final 1 M), 117 g NaCl (final 2 M). Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months. | ||
| 0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7 | buffer | 69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature. | ||
| 1 M MgCl2 | 50.8 g MgCl2.6H2O Adjust to 250 ml with water. Store at room temperature. | |||
| 10% (w/v) SDS | 20 g SDS Adjust to 200 ml with water. Store at room temperatur |
