L’immunosociazione degli ovociti in fase avanzata di Drosophila può rivelarsi impegnativa a causa delle membrane circostanti degli ovociti. Questo video descrive un metodo ad alta produttività per ottenere gli ovociti, la loro fissazione e la rimozione delle membrane per l’immunosociazione. Il protocollo in primo piano dimostra queste tecniche con ovociti in fase avanzata utilizzati per visualizzare diversi stadi della meiosi.
Protocol
Questo protocollo è tratto da Radford e McKim, Techniques for Imaging Prometaphase e Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016). NOTA: Le procedure vengono eseguite a temperatura ambiente, salvo diversa indicazione. Gli incubatori a temperatura controllata vengono utilizzati per mantenere le temperature per l’allevamento a mosca e le croci, salvo diversa indicazione. 1. Preparativi …
Representative Results
droga solvente Concentrazione di scorte Concentrazione finale Tempo di trattamento effetto colchicina etanolo 125 mM 150 μM 10 min o 30 min destabilizzare il non-kinetochore (10 min)o tutti i mi…
Materials
16% formaldehyde
Ted Pella, Inc.
18505
HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers
Various
5 ml tubes
Various
active dry yeast
Various
mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
Binucleine 2
Sigma
B1186
HAZARDOUS
blender
Various
bovine serum albumin
Sigma
A4161
calcium chloride
Various
colchicine
Sigma
C-9754
HAZARDOUS
coverslips
VWR
48366-227
No. 1 1/2
DMSO
Various
EGTA
Various
ethanol
Various
forceps
Ted Pella, Inc.
5622
Dumont tweezers high precision grade style 5
glass slides
VWR
48312-003
glucose
Various
HEPES
VWR
EM-5330
available from several venders
magnesium chloride
Various
large mesh (~1,500 µm)
VWR
AA43657-NK
variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm)
Spectrum labs
146 424
variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator
Various
Pasteur pipets
Various
potassium acetate
Various
Cacodylic acid
Sigma
C0125
HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
Preparation of Fixed Drosophila Oocytes for Immunostaining: A High-Throughput Method to Fix and Remove the Outer Membrane. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20122, doi: (2023).