Immunostaining av Drosophila senfase oocytter kan vise seg utfordrende på grunn av oocyttene rundt membraner. Denne videoen beskriver en metode for høy gjennomstrømning for å oppnå oocytter, fiksering og membraners fjerning for immunstaining. Den omtalte protokollen demonstrerer disse teknikkene med senfase oocytter som brukes til å visualisere ulike stadier av meiosis.
Protocol
Denne protokollen er hentet fra Radford og McKim, Teknikker for imaging Prometaphase og Metafase av Meiosis I i Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016). MERK: Prosedyrer utføres ved romtemperatur med mindre annet er angitt. Temperaturkontrollerte inkubatorer brukes til å opprettholde temperaturer for flueoppdrett og kryss med mindre annet er angitt. 1. Forberedelser Forbered fluer. Prometapha…
Representative Results
Stoffet Løsemiddel Lagerkonsentrasjon Endelig konsentrasjon Tidspunkt for behandling Effekt kolchicin Etanol 125 mM 150 μM 10 min eller 30 min destabilisere ikke-kinetochore (10 min)eller alle …
Materials
16% formaldehyde
Ted Pella, Inc.
18505
HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers
Various
5 ml tubes
Various
active dry yeast
Various
mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
Binucleine 2
Sigma
B1186
HAZARDOUS
blender
Various
bovine serum albumin
Sigma
A4161
calcium chloride
Various
colchicine
Sigma
C-9754
HAZARDOUS
coverslips
VWR
48366-227
No. 1 1/2
DMSO
Various
EGTA
Various
ethanol
Various
forceps
Ted Pella, Inc.
5622
Dumont tweezers high precision grade style 5
glass slides
VWR
48312-003
glucose
Various
HEPES
VWR
EM-5330
available from several venders
magnesium chloride
Various
large mesh (~1,500 µm)
VWR
AA43657-NK
variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm)
Spectrum labs
146 424
variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator
Various
Pasteur pipets
Various
potassium acetate
Various
Cacodylic acid
Sigma
C0125
HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
Preparation of Fixed Drosophila Oocytes for Immunostaining: A High-Throughput Method to Fix and Remove the Outer Membrane. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20122, doi: (2023).