La inmunodetención de ocitos en etapa tardía de Drosophila puede resultar difícil debido a las membranas circundantes de los ocitos. Este video describe un método de alto rendimiento para obtener ocitos, su fijación y la eliminación de membranas para la inmunodetención. El protocolo destacado demuestra estas técnicas con ocitos en etapa tardía utilizados para visualizar diferentes etapas de la meiosis.
Protocol
Este protocolo se extrae de Radford y McKim, Técnicas para la Prometafase por Imágenes y Metafase de Meiosis I en Oocitos Drosophila Fijos, J. Vis. Exp. (2016). NOTA: Los procedimientos se realizan a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. Las incubadoras con temperatura controlada se utilizan para mantener las temperaturas para la cría de moscas y cruces a menos que se indique lo contrario. 1. Prep…
Representative Results
droga solvente Concentración de existencias Concentración final Tiempo de tratamiento efecto colchicina etanol 125 mM 150 μM 10 min o 30 min desestabilizar non-kinetochore (10 min)o todos (30 …
Materials
16% formaldehyde
Ted Pella, Inc.
18505
HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers
Various
5 ml tubes
Various
active dry yeast
Various
mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
Binucleine 2
Sigma
B1186
HAZARDOUS
blender
Various
bovine serum albumin
Sigma
A4161
calcium chloride
Various
colchicine
Sigma
C-9754
HAZARDOUS
coverslips
VWR
48366-227
No. 1 1/2
DMSO
Various
EGTA
Various
ethanol
Various
forceps
Ted Pella, Inc.
5622
Dumont tweezers high precision grade style 5
glass slides
VWR
48312-003
glucose
Various
HEPES
VWR
EM-5330
available from several venders
magnesium chloride
Various
large mesh (~1,500 µm)
VWR
AA43657-NK
variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm)
Spectrum labs
146 424
variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator
Various
Pasteur pipets
Various
potassium acetate
Various
Cacodylic acid
Sigma
C0125
HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
Preparation of Fixed Drosophila Oocytes for Immunostaining: A High-Throughput Method to Fix and Remove the Outer Membrane. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20122, doi: (2023).