माउस मस्तिष्क के ऊतकों के Immunoelectron माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार
Summary
हम चूहों, हटाने और मस्तिष्क के सेक्शनिंग, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से immunoperoxidase धुंधला हो जाना, राल एम्बेडिंग, और ultrathin मस्तिष्क वर्गों के सेक्शनिंग के transcardiac छिड़काव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इन प्रक्रियाओं के पूरा होने पर, immunostained सामग्री संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ परीक्षा के लिए तैयार है.
Abstract
संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) microglial, oligodendrocytic, astrocytic, और neuronal subcellular (dendrite, वृक्ष के समान रीढ़ की हड्डी, अक्षतंतु, अक्षतंतु टर्मिनल, perikaryon) डिब्बों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उनके intracellular organelles cytoskeleton है और दृश्यमान करने के लिए अत्यंत उपयोगी है, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में उच्च स्थानिक संकल्प. के रूप में प्रस्तुत, मंदिर के साथ संयुक्त, पूर्व एम्बेडिंग immunocytochemistry कुछ विशिष्ट सुविधाओं और पहचान मानदंड (जैसे, microglial perikarya और प्रक्रियाओं, जब microglia Iba1 विशिष्ट मार्कर (आयनित कैल्शियम बाध्यकारी एडाप्टर एक अणु के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग कर के साथ सेलुलर तत्वों की भेदभाव की अनुमति देता है यहाँ)), सेलुलर तत्वों की neurotransmitter सामग्री (जैसे, serotonergic) और उनके घुलनशील या झिल्ली बाध्य प्रोटीन की ultrastructural स्थानीयकरण (जैसे, 5 HT1A और EphA4 रिसेप्टर्स) की पहचान. यहाँ, हम acrolein लगानेवाला, हटाने और मस्तिष्क के सेक्शनिंग, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से immunoperoxidase diaminobenzidine धुंधला (थपका), राल एम्बेडिंग, और ultrathin मस्तिष्क वर्गों के सेक्शनिंग के साथ चूहों के transcardiac छिड़काव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इन प्रक्रियाओं के पूरा होने पर, immunostained सामग्री मंदिर के साथ परीक्षा के लिए तैयार है. जब कड़ाई से प्रदर्शन किया, इस तकनीक का इष्टतम ultrastructural संरक्षण और immunocytochemical पता लगाने के बीच एक उत्कृष्ट समझौता प्रदान करता है.
Protocol
Discussion
यहाँ हम माउस मस्तिष्क के ऊतकों के immunoelectron माइक्रोस्कोपी है कि इष्टतम ultrastructural संरक्षण और immunocytochemical पता लगाने, जब प्रक्रियाओं को कड़ाई से प्रदर्शन कर रहे हैं के बीच एक उत्कृष्ट समझौता प्रदान करता है के लिए तैय?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप और vibratome का उपयोग, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तकनीकी सहायता के लिए रोचेस्टर मेडिकल सेंटर के विश्वविद्यालय के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप रिसर्च कोर सुविधा पर करेन एल बेंटले और गेल Schneider के लिए शाओ मिंग लू और हैरिस ए Gelbard धन्यवाद. इस काम एनआईएच (EY019277), व्हाइटहॉल फाउंडेशन, Burroughs Wellcome कोष, और अल्फ्रेड पी. स्लोअन फाउंडेशन AKM करने के लिए से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था. M.-È.T. एक Fonds डी ला Recherche एन SANTE डु (FRSQ) postdoctoral प्रशिक्षण पुरस्कार क्यूबेक द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium pentobarbital (Nembutal) | Ovation Pharmaceuticals | |||
| Filter paper 315 24 cm | VWR | 28331-081 | ||
| *Acrolein purum (≥95%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 01680 | ||
| Sodium borohydride (≥98%) | Sigma-Aldrich (Aldrich) | 452173 | ||
| *Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%) | Sigma-Aldrich | 441244 | ||
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | ||
| Rabbit anti-Iba1 primary antibody | Wako | 019-19741 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 111-066-046 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| Peroxidase-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| *Osmium tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Light sensitive | |
| Propylene oxide (≥99%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 82325 | ||
| Polypropylene disposable beakers (50 mL) | Fisher | 01-291-10 | ||
| Aluminium weigh dishes (70 mm) | Fisher | NC9261784 | ||
| Durcupan epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14040 | ||
| Embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70907 | ||
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich (BioChemika) | 44581 | ||
| Gelatin subbed slides | VWR | 100241-864 | ||
| ACLAR embedding films (7.8 mm) | Electron Microscopy Sciences | 50425 | ||
| Capsule mold | Electron microscopy Sciences | 70150 | ||
| High-performance super glue | Corporate Express | LOC30379 | ||
| Perfect loop for ultra thin sections | Electron Microscopy Sciences | 70944 | ||
| Superfrost slides | Fisher | 22-178-277 | ||
| Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm) | Diatome | |||
| Gelatin from cold water fish skin (~45%) | Sigma-Aldrich (Sigma) | G7765 |
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly.
References
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- Tremblay, M. E. Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus. J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).
- Tremblay, M. E. Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus. J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).
- Bouvier, D. Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain. J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).
- Bouvier, D. EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain. J Neurochem. , (2010).
