DNA Stabile-isotopica Probing (DNA-SIP)
Summary
DNA-isotopo stabile sondaggio è un metodo di coltivazione-indipendente di identificare e caratterizzare le comunità di microrganismi attivi che sono in grado di utilizzare substrati specifici. L'assimilazione del substrato arricchito in isotopo pesante porta alla costituzione degli atomi indicati sull'etichetta in biomassa microbica. Ultracentrifugazione gradiente di densità recupera DNA etichettato per la valle analisi molecolari.
Abstract
DNA-isotopo stabile sondaggio (DNA-SIP) è una tecnica potente per identificare i microrganismi attivi che assimilare particolari substrati di carbonio e di sostanze nutritive in biomassa cellulare. Come tale, questa coltura-indipendente tecnica è stata una metodologia per l'assegnazione di importanti funzioni metaboliche per le diverse comunità che abitano una vasta gamma di ambienti terrestri e acquatici. Dopo l'incubazione di un campione ambientale con isotopi stabili-molecole marcate, estratto acido nucleico è sottoposto a ultracentrifugazione gradiente di densità e di frazionamento gradiente successive per separare gli acidi nucleici di quote differenziate. Purificazione del DNA da cloruro di cesio recupera etichettati e privi di etichetta del DNA per la successiva caratterizzazione molecolare (ad esempio le impronte digitali, microarray, biblioteche clone, metagenomica). Questo protocollo video JOVE fornisce visive passo-passo le spiegazioni del protocollo per il frazionamento gradiente ultracentrifugazione gradiente di densità, e il recupero del DNA marcato. Il protocollo include anche i dati del campione SIP ed evidenzia importanti suggerimenti e precauzioni che devono essere considerati per assicurare il successo del DNA-SIP analisi.
Protocol
Discussion
Corretta progettazione di stabili-isotopo esperimenti sondaggio è di importanza critica per l'ottenimento di DNA marcato al di sopra della comunità sfondo senza etichetta. Considerazioni relative a tempi di incubazione del campione, le concentrazioni di substrato, condizioni di incubazione (per esempio nutrienti, umidità del suolo), alimentazione incrociata e la replicazione sono stati discussi altrove 10,18 e si raccomanda al lettore di consultare le pubblicazioni quando si progetta un incubazione SIP…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Progetto Strategico e borse di Discovery per JDN dalle scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada (NSERC).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bromophenol Blue | Reagent | Fisher Scientific | BP115-25 | |
| Cesium chloride | Reagent | Fisher Scientific | BP210-500 | |
| Ethanol, reagent grade | Reagent | Sigma-Aldrich | 652261 | |
| Ethidium bromide | Reagent | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Hydrochloric acid | Reagent | Fisher Scientific | 351285212 | |
| Linear polyacrylamide | Reagent | Applichem | A6587 | |
| Polyethylene Glycol 6000 | Reagent | VWR | CAPX1286L-4 | |
| Potassium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | AC42409-0010 | |
| Sodium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | S2711 | |
| Sodium Hydroxide pellets | Reagent | Fisher Scientific | S3181 | |
| Tris base | Reagent | Fisher Scientific | BP1521 | |
| Dark Reader | Equipment | Clare Chemical | DR46B | |
| Microcentrifuge | Equipment | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| Nanodrop 2000 | Equipment | Fisher Scientific | 361013650 | |
| Infusion pump | Equipment | Braintree Scientific | N/A | Model Number: BSP See www.braintreesci.com for ordering details. |
| Tube sealer | Equipment | Beckman-Coulter | 358312 | |
| Ultracentrifuge | Equipment | Beckman-Coulter | ||
| Ultracentrifuge rotor | Equipment | Beckman-Coulter | 362754 | |
| Ultraviolet light source | Equipment | UVP Inc. | 95-0017-09 | Any UV source will suffice |
| Ultraviolet light face shield | Equipment | Fisher Scientific | 114051C | |
| Butyl rubber stoppers, gray | Material | Sigma-Aldrich | 27232 | |
| Centrifuge tubes | Material | Beckman-Coulter | 342412 | |
| Hypodermic needle, 23 gauge, 2” length | Material | BD | 305145 | |
| Microfuge tubes, 1.5 mL | Material | DiaMed | AD151-N500 | |
| Open center seals, 20 mm diameter | Material | Sigma-Aldrich | 27230-U | |
| Pasteur pipettes, glass | Material | Fisher Scientific | 13-678-6C | |
| Pipet tips | Material | DiaMed | BPS340-1000 | Catalogue number is for 200 μl tips. 10 or 20 μl tips may be purchased from the same source |
| Pump tubing 1.5 mm bore x 1.5 mm wall | Material | Appleton Woods | ||
| Screw-cap tubes, 15 mL | Material | DiaMed | AD15MLP-S | |
| Serum vials, 125 mL volume | Material | Sigma-Aldrich | Z114014 | |
| Syringe, 60 mL | Material | BD | 309653 |
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