ゼブラフィッシュ胚眼の組織の顕微解剖
Summary
この記事では、1〜3日postfertilizationの胚から、接続されている網膜色素上皮がある場合とない場合のゼブラフィッシュ網膜を顕微解剖するアプローチを説明します。
Abstract
ゼブラフィッシュは、その急速の眼の発生に関する研究のための人気の動物モデルである<em> EX子宮</em>開発と良い産卵。 3日後の受精（DPF）によって、幼虫は、最初の視覚的な応答が表示されます。多くの遺伝子は、適切な眼の発生を制御するために同定されたが、我々は、基礎となる遺伝的構造の完全な理解にはほど遠いですされています。全ゲノムの遺伝子発現プロファイリングは、眼の開発のための遺伝子調節ネットワークを解明するために有用なツールです。しかし、ゼブラフィッシュの胚の眼の小さいサイズは、それが挑戦的な発現解析のための完全な、純粋な眼の組織を得ることができる。レンズの径が100μm以下であるたとえば、2日目と3の間に目の前後の長さは、唯一の約200から300μmである。また、網膜の根底にある網膜色素上皮（RPE）はちょうど単層上皮である。遺伝子発現プロファイルは全胚から得られる一方で、彼らは正確にこれらの組織の表現を表すものではありません。したがって、純粋な組織は、眼の開発の成功した遺伝子発現プロファイリングのために取得する必要があります。この問題に対処するために、我々は、眼の形態形成の主要な段階をカバーする1から3 DPF、から添付RPEで無傷の網膜と網膜を顕微解剖する手法を開発しました。すべての手順は、標準的な実体顕微鏡下で微細な鉗子と一般的な実験室の電源で行うことができます。網膜の解剖のために、単層RPEは、アクションと解剖のための培養プレートの表面にRPEの残党の優先的な遵守をブラッシングして除去し、剥離する。 RPEが完全に網膜で保存できるように、RPEに接続された網膜節郭清については、解剖のプレートにRPEの遵守は、解剖前に削除されます。この組織を慎重に持ち上げアクションは、効率的に推定脈絡膜と強膜を分離することができます。レンズは、化学的にエッチングされたタングステンの針が両方のケースで削除することができます。要するに、我々のアプローチは、そのまま眼の組織を得ることができますし、正常にゼブラフィッシュの網膜の組織特異的発現プロファイルを研究するために利用されている<sup> 1、2</sup>と網膜色素上皮<sup> 3</sup>。
Protocol
Discussion
ゼブラフィッシュの眼の組織の顕微解剖は、効果的に無傷の網膜とRPEに接続された網膜を取得することができます。これは実質的に特定の眼組織（すなわち、網膜や網膜色素上皮）に関連する発現研究を支援します。実際に、我々が正常に全体の網膜1とRPE 3のRNAの発現プロファイルを取得するには、次の手順を利用してきた。これらのプロファイルのユーティリティが強く網…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、パーデュー大学で生物科学科からのスタートアップ資金によってサポートされています。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cordless pestle motor | VWR | 47747-370 | ||
| DC power supply | Lascar | PSU130 | Any DC supply would work. The specific voltage of a different machine will need further optimization. | |
| Disposable pestle & microtube, 1.5 mL (DNase, RNase and pyrogen-free) | VWR | 47747-366 | These are used for tissue collection in TRIzol for expression analysis. | |
| Dumont #5 forceps, Tips: 0.05 x 0.01mm, Inox | World Precision Instruments | 500341 | Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time. | |
| Dumont #5SF forceps, Tips: 0.025 x 0.005mm, Inox | Fine Science Tools | 11252-00 | Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time. | |
| Falcon polystyrene culture plates, 60 X 15 mm | BD Biosciences | 351007 | These plates are used as dissection plates. | |
| Olympus SZX16 Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Any stereomicroscope would work. We used Leica stereomicroscope in previous studies1-3 without any issues. We also use the 1X objective exclusively for the dissection even though we have a 2X objective installed. | |
| Sharpening stone | Fine Science Tools | 29008-01 | Use this to sharpen the tip of the forceps if necessary | |
| Thermo plate | Tokai Hit | MATS-U55SZX2B | This is used to maintain the temperature of the tissue throughout dissection and minimize the influence of temperature fluctuation on gene expression. We also put the whole microscope in an environmentally controlled room at 28°C during dissection in previous studies1-3 with good success. | |
| Trizol, 100 mL | Invitrogen | 15596-026 | ||
| tungsten wire, 0.015 inch diameter | World Precision Instruments | TGW1510 | ||
| Wooden Applicator | Puritan | 807 | This is used for holding the chemically-etched tungsten needle. |
References
- Leung, Y. F., Dowling, J. E. Gene expression profiling of zebrafish embryonic retina. Zebrafish. 2, 269-283 (2005).
- Leung, Y. F., Ma, P., Link, B. A., Dowling, J. E. Factorial microarray analysis of zebrafish retinal development. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 12909-12914 (2008).
- Leung, Y. F., Ma, P., Dowling, J. E. Gene expression profiling of zebrafish embryonic retinal pigment epithelium in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 881-890 (2007).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish : a practical approach. , (2002).
- Westerfield, M. The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
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