Microdissecção de tecidos oculares Zebrafish embrionárias

Summary

Este artigo descreve uma abordagem para microdissect retinas zebrafish com e sem epitélio pigmentar da retina em anexo, 1-3 embriões dia postfertilization.

Abstract

Peixe-zebra é um modelo animal popular para a pesquisa sobre o desenvolvimento do olho por causa de sua rápida<em> Ex utero</em> Desenvolvimento e fecundidade bom. Por 3 dias após a fertilização (DPF), as larvas irá mostrar a primeira resposta visual. Muitos genes foram identificados até o controle de um desenvolvimento adequada para os olhos, mas estamos longe de um entendimento completo da arquitetura genética subjacente. Todo o genoma perfil de expressão gênica é uma ferramenta útil para elucidar rede regulatória genética para o desenvolvimento do olho. No entanto, o pequeno tamanho do olho embrionárias em peixes-zebra torna difícil obter tecidos oculares intacta e pura para análise de expressão. Por exemplo, o comprimento ântero-posterior do olho entre o dia 2 e 3 é apenas cerca de 200-300 mM, enquanto que o diâmetro da lente é mM menos 100. Além disso, o epitélio pigmentar da retina (EPR) subjacente à retina é apenas um epitélio de camada única. Enquanto perfis de expressão gênica pode ser obtido a partir do embrião todo, eles não representar fielmente a expressão desses tecidos. Portanto tecido puro deve ser obtido por um perfil de expressão gênica de sucesso do desenvolvimento do olho. Para resolver este problema, temos desenvolvido uma abordagem para microdissect retina intacta e retina com RPE anexada de dpf 03/01, que cobrem grandes etapas da morfogênese do olho. Todos os procedimentos podem ser feitos com uma pinça fina e material de laboratório em geral sob oculares standard. Para dissecção da retina, o RPE single-layer é removida e descascada por escovar a ação ea adesão preferencial dos remanescentes RPE para a superfície da placa de cultura para dissecção. Para RPE ligado à dissecção da retina, a adesão de RPE para a placa de dissecção é removido antes da dissecção de modo que a RPE pode ser completamente preservada com a retina. Uma ação de levantamento cuidadoso deste tecido pode eficientemente separar a coróide presuntivo e esclera. A lente pode ser removido em ambos os casos por uma agulha de tungstênio gravado quimicamente. Em resumo, nossa abordagem pode obter tecidos oculares intactos e tem sido utilizada com sucesso para estudar perfis de tecidos específicos expressão da retina zebrafish^{1, 2} E epitélio pigmentar da retina³.

Protocol

Parte 1: Preparativos antes microdissecção Soluções E3 média 4 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 e 0,33 mM MgSO 4). Solução de Ringer com 1, 5 (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 5 mM HEPES, pH7.2), esterilizado por filtração. 5N NaOH. Ataque químico de agulhas de tungstênio Garantir um pequeno copo contendo NaOH 5N sobre uma placa de Petri por ar…

Discussion

Microdissecção de tecidos oculares zebrafish pode efetivamente obter retinas intactas e RPE-anexado retinas. Este auxilia substancialmente estudos de expressão que pertencem a um tecido ocular específico (ie retina ou RPE). Na verdade, temos utilizado com sucesso destes procedimentos para obter perfis de expressão de RNA de toda a retina ¹ e RPE ^3. A utilidade destes perfis é fortemente apoiado pelos nossos recente identificação de vias e famílias de genes que são perturbados em uma difer…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Cordless pestle motor		VWR	47747-370
DC power supply		Lascar	PSU130	Any DC supply would work. The specific voltage of a different machine will need further optimization.
Disposable pestle & microtube, 1.5 mL (DNase, RNase and pyrogen-free)		VWR	47747-366	These are used for tissue collection in TRIzol for expression analysis.
Dumont #5 forceps, Tips: 0.05 x 0.01mm, Inox		World Precision Instruments	500341	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Dumont #5SF forceps, Tips: 0.025 x 0.005mm, Inox		Fine Science Tools	11252-00	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Falcon polystyrene culture plates, 60 X 15 mm		BD Biosciences	351007	These plates are used as dissection plates.
Olympus SZX16 Stereomicroscope		Olympus	SZX16	Any stereomicroscope would work. We used Leica stereomicroscope in previous studies1-3 without any issues. We also use the 1X objective exclusively for the dissection even though we have a 2X objective installed.
Sharpening stone		Fine Science Tools	29008-01	Use this to sharpen the tip of the forceps if necessary
Thermo plate		Tokai Hit	MATS-U55SZX2B	This is used to maintain the temperature of the tissue throughout dissection and minimize the influence of temperature fluctuation on gene expression. We also put the whole microscope in an environmentally controlled room at 28°C during dissection in previous studies1-3 with good success.
Trizol, 100 mL		Invitrogen	15596-026
tungsten wire, 0.015 inch diameter		World Precision Instruments	TGW1510
Wooden Applicator		Puritan	807	This is used for holding the chemically-etched tungsten needle.