Établir des cultures primaires de fibroblastes adultes à partir de rongeurs

Summary

Cet article décrit un protocole pour l'isolement et l'entretien des cultures de fibroblastes primaires de la peau et les tissus pulmonaires de rongeurs sauvages.

Abstract

L'importance de l'utilisation de cellules primaires, plutôt que de lignées cellulaires de cancer, pour des études biologiques est de plus largement reconnu. Les cellules primaires sont préférés dans les études sur le contrôle du cycle cellulaire, l'apoptose, et la réparation de l'ADN, les cellules cancéreuses sont porteurs de mutations dans les gènes impliqués dans ces processus. Les cellules primaires ne peuvent pas être cultivées indéfiniment en raison de l'apparition de la sénescence réplicative ou aneuploidization. Ainsi, de nouvelles cultures doivent être établis régulièrement. La procédure d'isolement de fibroblastes embryonnaires de rongeurs bien établie, mais d'isoler des cultures de fibroblastes adultes représente souvent un défi. Fibroblastes de rongeurs adultes isolés de modèles murins de maladies humaines peut être un contrôle préféré quand on les compare à des fibroblastes provenant de patients humains. Par ailleurs, les fibroblastes adultes sont les seuls matériaux disponibles lorsque vous travaillez avec des rongeurs sauvages où les femmes enceintes ne peuvent pas être obtenus facilement. Ici nous fournissons un protocole pour l'isolement et la culture de fibroblastes adultes de la peau des rongeurs et des poumons. Nous avons utilisé cette procédure avec succès pour isoler les fibroblastes de plus de vingt espèces de rongeurs à partir des souris de laboratoire et des rats à des rongeurs sauvages tels que le castor, le porc-épic et l'écureuil.

Protocol

1. Avant de partir Stériliser des ciseaux et des pinces à l'éthanol 70%. Placer les petits agitateur magnétique dans un bécher 30 mL, couvrir avec deux couches de papier d'aluminium, et autoclave. Préparer un 28 unités Wunsch / ml de solution stock Libérase Blendzyme 3 dans l'eau stérile. Faire aliquotes de 0,5 ml et congeler à -20 ° C. Dégeler une aliquote de nouvelles avant chaque utilisation. La solution peut paraître nuageux après décongélation. Vortex la so…

Discussion

Normale fibroblastes primaires fournissent une excellente alternative aux établie lignées cellulaires de cancer dans la recherche biologique. Un avantage important des fibroblastes est qu'ils ne portent des mutations dans les oncogènes et suppresseurs de tumeur et de maintenir intactes les points de contrôle du cycle cellulaire. Cela rend les fibroblastes normaux d'un système privilégié pour les études de la régulation du cycle cellulaire, la réparation de l'ADN, et l'apoptose. Le protocole dé…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
DMEM/F12 media		Invitrogen	11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified		Invitrogen	01437-036	The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic		Invitrogen	15420-096
Penicillin/Streptomycin		Invitrogen	15140-122
Liberase TM Research Grade		Roche	05401127001	Replacement enzyme.
				A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 – 10 mg, Cat. no. 05401127001 – 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media		ATCC	30-203	The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel		Multiple suppliers
Three Gas Control incubator		Forma or Heraeus