Судьба картирование человеческих эмбриональных стволовых клеток на формирование тератома

Summary

Направленной дифференцировки ЭСК в специфические клетки вызвал большой интерес в регенеративной медицине. Мы предоставляем краткие, шаг за шагом протокол для определения<em> В естественных условиях</em> Судьбу выбранного ЭСК, которая обеспечивает ценный инструмент для характеристики тканеспецифические реагентов для клеточной терапии.

Abstract

Человека эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) обладают неограниченной способностью к самообновлению, и способность дифференцироваться в клетки, полученные из всех трех эмбриональных зародышевых листков (1). Направленной дифференцировки ЭСК в специфические типы клеток вызвало большой интерес в области регенеративной медицины (например, (2-5)), и методы определения<em> В естественных условиях</em> Судьба выбран или манипулировать ЭСК имеют важное значение для этой деятельности. Мы адаптировали высокоэффективного анализа тератома образование для этой цели. Небольшое число специально отобранных ЭСК смешивается с недифференцированные ЭСК дикий тип и Phaseolus лектина обыкновенная сформировать осадок клеток. Это привитых под почечную капсулу в иммунодефицитных мышей. Каких-то 2,5 х 10⁵ ЭСК необходимо сформировать 16 см³ Тератома в течение 8-12 недель. Судьба первоначально выбранного ЭСК могут быть определены иммуногистохимии. Этот метод обеспечивает ценный инструмент для характеристики тканеспецифические реагентов для клеточной терапии.

Protocol

Письменный протокол ниже, основывается на опубликованных параметров сообщают авторы, с некоторыми изменениями. Протокола осуществляется с одобрения UCSF Институциональные уходу и использованию животных (IACUC) и Исследования стволовых клеток надзора (SCRO) комитетов. I. культуры человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) Расти ЭСК в стандартной 6-а (3,5 см в диаметре скважин) пластин. По крайней мере за 12 часов до пассажей клеток, семян мышиных эмбриональных фибробластов (MEF, полученные из CF1 день e12.5 приурочен-лых мышей, облученных при 1000 Ки) фидерных клеток на пластинах покрыта 1% желатина (6,7). MEFs должны быть покрыты на 50-60% слияния, или 4 х 10 5 клеток на 3,5 см в диаметре скважины (рис. 1). Прохождение клеток при колонии достигла ~ 70% слияния (рис. 2). Для прохождения клетки, аспирацию роста KSR среды (6) из колодцев и заменить с 0,5 мл среды, содержащей коллагеназы IV в KSR при концентрации 1 мг / мл. Инкубируйте пластин с коллагеназы IV при 37 ° C / 5% CO 2 в течение 5 минут или пока края колонии начинают снять с плиты. Удалить коллагеназы IV от плиты, добавить 0,5 мл KSR в каждую лунку, так и вручную очистить клетки, чтобы полностью удалить из пластины. Сбор клеточной суспензии из каждой лунки, место в 15 мл коническую трубку, и позволяют клеткам урегулировать под действием силы тяжести в течение 5 минут. Удалить супернатант из трубки, в результате чего клетки и среды в общем объеме 300 мкл ~. Использование 200 мкл микро-дозаторов устанавливается в полном объеме, аккуратно пипеткой клеточной суспензии 5-6 раза, чтобы разбить колоний. Принесите клеточной суспензии с общим объемом 9 мл на оригинальные и ячеек с помощью KSR среде (то есть, если один хорошо собирается, трубка должна содержать 9 мл). Дополнение среде с рекомбинантный человеческий основной фактор роста фибробластов (bFGF) до концентрации 12,5 нг / мл. После мытья новых скважин содержащих MEF клеток (см. шаг 2) с фосфатом Дульбеко буферного раствора (DPBS), чтобы удалить все сыворотки, добавляют 3 мл клеточной суспензии в каждую лунку и инкубировать пластин при 37 ° C / 5% СО 2. Изменение KSR среде с bFGF 24 часов после прохода, и каждые 24-48 часов, пока клетки готовы к пассировать еще раз. II. Подготовка чЭСК гранулы для пересадки На 24 часов до пересадки, добавьте ROCK ингибитор KSR средней конечной концентрации 10 мкм увеличить жизнеспособность клеток (8). Одним из хорошо клеток на ~ 70% слияния (5 х 10 5 клеток) приведет к созданию двух гранул, с двумя гранулы вставляется в почечную капсулу. Для подготовки клетка таблеток для пересадки (9), инкубировать ROCK ингибитор обработанных культур с коллагеназы IV в течение 5 минут при 37 ° C / 5% СО 2. Аспирируйте коллагеназы IV из колодца и заменить с 1 DPBS мл с 10% пенициллина / стрептомицина (ручка / стрептококк). Вручную очистить колоний от пластины, полоскание хорошо с дополнительно 1 мл DPBS пером / стрептококк, и передача каждого 1 мл аликвоту суспензии клеток в 1,5 трубки микроцентрифужную мл. Спиновые микроцентрифужную труб кратко в 8000 х г, аспирация супернатант, и ресуспендируют гранул в 500 мкл DPBS пером / стрептококк. Чтобы помочь связывают клетки между собой для трансплантации, добавьте 100 мкл 1 мг / мл Phaseolus обыкновенная лектина (PHA) в DPBS в каждую пробирку. Инкубируйте клетки / PHA суспензии при комнатной температуре в течение 5 минут, затем спина в течение 2 минут при 8000 х г. Поворот трубы на 180 ° в пределах их ротора скважин и спина снова в течение 2 минут при 8000 х г. Тщательно аспирата супернатант оставляя осадок нетронутыми. Выбить ячейки гранул из трубы, осторожно пипеткой 200 мкл KSR рядом с краем гранул, пока она медленно поднимается. Как только смещаются, немедленно передать гранулы 0.4μm MILLICELL вставки помещается в 3,5 см в диаметре скважин, содержащий 3 мл KSR, и выдержать в течение 2 часов ночи при 37 ° C / 5% СО 2. III. Почечная капсула прививки Выполнение всех животных процедур в соответствии с руководящими принципами институциональной с использованием соответствующих правил асептики. Обезболить SCID бежевый мышей (CB17.Cg-Prkdc SCID лизатора BG / CRL), в возрасте 8-12 недель, используя сочетание ингаляционных 3% isoflurane/0.5% O2 и внутрибрюшинного tribromoethanol (Avertin; 25 мг / кг свежеприготовленный). Две ячейки гранул на мышь будет привита использованием описанных техник (10). После размещения мыши на грелку, чтобы предотвратить переохлаждение, побриться области разреза, то вылечить хлоргексидином. Сделать 2,5 см разрез через кожу недалеко от центра, но параллельно позвоночнику. Хранение влажного области разреза стерильным Салине, сделать меньше разрез через мышцу, чуть ниже ребер и ~ 1 см от позвоночника. Разреза должна быть достаточно большой, чтобы тянуть через почки, но мало, что почки не скользят обратно в брюшную полость без применения силы. Вытяните почек мягко через разрез мышцы с помощью стеклянной пипетки Пастера, который был втянут в форме тупого, слегка изогнутые трубки. Влажные почек стерильным DPBS для предотвращения капсулы от высыхания. Это может быть необходимо повторять на протяжении всей процедуры, так как капсула очень хрупкая. Использование Дюмон # 5 пинцетом, осторожно потяните капсулы по сравнению с почками и сделать 2 мм разрез с помощью ножниц Vannas весной. С другой стеклянной пипетки, которые были втянуты в очень тонкий, притупляются зонд, сделайте небольшой карман между капсулой и почек. Использование большого отверстия пипетки помещают на одноразовые пипетки передачи, принять единый клеточный осадок от вставки MILLICELL. Убедитесь в том, чтобы занять всего лишь дополнительные средства массовой информации по возможности, как избыток средств массовой информации может помешать передаче гранул. Удерживая до края разреза, чтобы создать карман, осторожно положите шарик рядом с открытия и столкнуть ее в карман к одному полюсу почки с вытащил пипетки. Повторите процесс со второй гранул. Место это под капсулой из другого теста, а на противоположном полюсе. Осторожно поместите капсулу обратно вниз на гранулы. Гранулы должны оставаться в пределах кармана, а не швы необходимо закрыть капсулы. Аккуратно нажмите почек обратно в брюшную полость и закрыть мышц стене с помощью 4-0 швов шелк (или меньше) с прикрепленными обратного резки иглы. Разрез должен быть достаточно небольшим, что только один шов необходимо. Закрыть кожи серии 4-5 прервал стежки, используя те же шовный материал. Перед размещением мышь обратно в свою клетку, администрирования 0,05 мг / кг бупренорфин (11,12) и 5 ​​мг / кг кетопрофен (12,13) ​​в качестве краткосрочных и долгосрочных анальгетики, соответственно. Регулируемые вещества должны использоваться только в соответствии с ведомственным руководящим принципам. Передача животных обратно в клетку и дать ему оправиться от наркоза на грелку. Это должно занять около 20-30 минут. Как только мышь полностью амбулаторно, оно может быть возвращено на объект жилищного животного. IV. Тератома сбора, фиксации и секционирования В 8-12 недель после операции, не должно быть едва ощутимыми тератома возле почек. Большие, наполненные жидкостью кисты часто будет развиваться, а, начиная с 6-8 недель. Эти могут потребовать ранее урожай, если они причиняют страдания животным. С тератомы расти более медленными темпами, чем кисты, однако, вам нужно будет ждать столько, сколько можно получить тератома достаточного размера для анализа (то есть, по крайней мере 8 недель). Удаление почки, тератома, и любой окружающий кисты в виде блока ткани из брюшной полости с использованием тех же хирургических подход, при котором почка была первоначально доступ (см. раздел III, пункты 1-4 выше). Место весь блок вырезали ткани в пробирку, содержащую 10% буферный формалин. Разрешить тератома исправить течение ночи при 4 ° C. На следующий день, удалить тератомы из тюбика. Рассеките от любых кист и столько почек, возможно, не повреждая тератома себя (рис. 3). Большие тератомы могут быть сокращены в два раза для облегчения рассечения и вложение. Процесс тератома с использованием стандартного парафином фиксации техники. Автоматизированные устройства доступны (например, Shandon Гиперцентр): I. 80% алкоголя Flex 2-х часов II. 80% алкоголя Flex 1 час III. 85% алкоголя Flex 1,5 часа IV. 95% алкоголя Flex 1 час V. 100% Flex алкоголя 1 час VI. 100% Flex алкоголя 1 час VII. 100% Flex алкоголя 1 час VIII. Открытый-Rite 3 1 час IX. Открытый-Rite 3 1 час X. Открытый-Rite 3 1 час </TD> XI. Парафин (TissuePrep) 2-х часов XII. Парафин (TissuePrep) 2-х часов В. Immunohistochemistry и анализ Как только в парафин, раздел тератома в 5 мкм серийный ломтики с помощью роторного микротома, и плавать разделы на слайдах. Перед окрашиванием, испечь слайды, по крайней мере один час. Пятно слайды гематоксилином и эозином с использованием стандартных методов выявления тканевых структур представителю от каждой из трех эмбриональных зародышевых листков (рис. 4): I. Ксилол мыть 3-5 минут II. Ксилол 3-5 минут III. 100% спирта 3-5 минут IV. 100% спирта 3-5 минут V. 95% алкоголя 3-5 минут VI. 80% алкоголя 3-5 минут VII. Вода мытья (несколько изменений) 2 минуты VIII. Гилл гематоксилин # 3 2-5 минут IX. Вода мытья (несколько изменений) пока вода не станет чистой X. Скотт воды (до синего ядер) 3 и более минут XI. Вода мытья (несколько изменений) 1-2 минуты XII. Eosin Y 1 минута XIII. Вода мытья (несколько изменений) 30 секунд XIV. 80% алкоголя 1 минута XV. 95% алкоголя 2 минуты XVI. 95% алкоголя 2 минуты XVII в. 100% спирта 3 минуты XVIII в. 100% спирта (чистый) 3 минуты XIX в. Ксилол 2 минут или больше XX в. Ксилол 2 минут или больше Горы покровное на каждом слайде с Permount. VI. Представитель Результаты Рисунок 1. Покрытие облученного CF1 мышиных эмбриональных фибробластов в качестве фидерного слоя для культивирования ЭСК недифференцированные. MEFs высевают на ~ 50% слияния, как показано здесь, или 4 х 10 5 клеток на 3,5 см в диаметре и в 6-и культуре блюдо. Бар, 100 мкм. Рисунок 2. Пример subconfluent культуре недифференцированных ЭСК на слой фидерные MEF. ЭСК выращиваются на MEF фидерные слои до ~ 70% сливной, как показано здесь, то пассировать, как описано. Бар, 100 мкм. Рисунок 3. Пример эксплантированных тератомы. После эксплантации, тератома, почек, и любой аксессуар ткани фиксируются как блок в формалине, затем почки и аксессуаров ткани, тщательно отделаны прочь перед вложением в парафин. Рисунок 4. Тератомы производных из недифференцированных ЭСК содержат тканей представителем всех трех зародышевых листков в естественных условиях. Тератома, например, один изображен на рисунке 3, была разделена и окрашивали гематоксилином и эозином для идентификации эмбриональных тканей. ЭСК приводит к тканям производных от всех трех эмбриональных зародышевых листков (эктодермы (А, В), мезодермы (С), энтодермы (D). (А) находятся в стадии становления нейронные структуры трубки. (B) Примитивные плоского эпителия. (C) хряща окруженный капсулой уплотненной мезенхимы. (D) Железистая кишечной структуры. Бар, 100 мкм. Изображения перепечатана с разрешения автора. Рисунок 5. Тератома анализ может быть использован для отображения судьбу меченых, недифференцированные ЭСК. Как ранее опубликованных (9), смесь специальные коды для ЭСК с немаркированные ЭСК может быть использована для перевода судьбу меченых клеток в анализе образование тератомы. Как показано здесь, недифференцированные ЭСК выражения поверхности маркер, CD133, и помечены с повышенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP), были смешаны с немаркированные, недифференцированные ЭСК. Они были использованы для формирования тератомы путем почечной капсулы прививки. Иммуногистохимический анализ гематоксилином и эозином-окрашенные срезы тератома с анти-EGFP антител свидетельствует судьба нейроэктодермальная из ЭСК CD133 +. Тератомы были обработаны как показано на рисунке 4 и контрастно с анти-EGFP антител (коричневый) для локализации производные CD133 + GFP + клеток в тканях. CD133 +-клеток, полученных из (стрелки) были обнаружены в тканях, возникающие из эмбриональных эктодермы, в частности, нейронных эпителия (слева) и зарождающиеся нервной трубки-подобные структуры (справа). Бар, 100 мкм. Изображения перепечатана с разрешения автора. Желатин 0,1% свиной желатин 99,9% DPBS Добавить желатин в DPBS, инкубировать при 37 ° С в течение одного часа или пока все желатин переходит в раствор, и фильтр стерилизуют (0.22μm) перед использованием. MEF среда 10% эмбриональной телячьей сыворотки (квалифицированные) 90% Дульбеко изменения основных среднего (D-MEM) 1x L-глютамин 1x Pen / Strep Фильтры стерилизовать перед использованием. KSR (Knockout сыворотки Замена) среде 20% Замена KnockOut сыворотки 80% KnockOut D-MEM 1x L-глютамин 1x заменимые аминокислоты 0,1 мМ β-меркаптоэтанол / 12,5 нг / мл bFGF Фильтры стерилизовать. Хранить при температуре 4 ° С, но тепло до 37 ° C перед добавлением к клеткам. Добавить bFGF непосредственно перед употреблением. Коллагеназы IV Растворите 1 мг / мл в среде KSR, поставив при температуре 37 ° С в течение 1-2 часов или пока все порошок переходит в раствор. Фильтры стерилизовать. Avertin 0,25 г 2,2,2-tribromoethanol 0,25 мл 2-метил-2-бутанол Инкубировать при 37 ° С в течение ночи в форме 100%-ный раствор. За несколько часов до операции, развести до 2,5% рабочего раствора использованием DPBS и инкубировать при температуре 37 ° С в течение не менее 1 часа. Фильтры стерилизовать и аликвоту. Tribromoethanol очень светочувствительные, так что защищать от света, на всех этапах подготовки и использования. Подготовка не более 12-24 часов перед использованием. Бупренорфин 1 мг / мл маточного раствора в метаноле Развести до 0,015 мг / мл рабочего раствора использованием стерильных H 2 O. Хранить при -20 ° С до 1 месяца. Кетопрофен 0,5 мг / мл рабочего раствора в DPBS Добавить DPBS, инкубировать в течение ночи при 37 ° С в течение 1-2 часов или пока все порошок переходит в раствор. Фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° C.

Discussion

Мы адаптировали высокоэффективного анализа тератома образованию с целью отображения судьба дифференциации в ЭСК в естественных условиях окружающей среды. Небольшое число специально отобранных ЭСК смешивается с недифференцированные ЭСК дикий тип и Phaseolus лектина обыкновенная сформировать осадок клеток. Это привитых под почечную капсулу в иммунодефицитных мышей. Судьба первоначально выбранного ЭСК могут быть определены иммуногистохимии (Рисунок 5), как сообщалось ранее (9). Этот метод обеспечивает ценный инструмент для выявления и генерации тканеспецифические реагентов для клеточной терапии.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
2-Methyl-2-butanol		Sigma-Aldrich	240486	Avertin
2,2,2-Tribromoethanol		Sigma-Aldrich	T48402	Avertin
4-0 silk sutures		Ethicon	641G
bFGF		R&D Systems	233FB
Buprenorphine		Sigma-Aldrich	B7536
Clear-Rite 3		Fisher	22-046-341
Collagenase IV		Sigma-Aldrich	C5138
D-MEM		Invitrogen	11965
DPBS		Invitrogen	14190
Dupont #5 forceps		WPI	500233	Kidney capsule
Eosin Y		Fisher	23-245-658
Fetal Bovine Serum (Qualified)		Invitrogen	26140-079
Flex alcohol		Fisher	22-046344
Gill’s Hematoxylin #3		Fisher	22-050-204
Hemostat, straight		WPI	501241	General surgery
Iris forceps		WPI	15914	General surgery
Ketoprofen		Sigma-Aldrich	K2012
KnockOut D-MEM		Invitrogen	10829
KnockOut Serum Replacement		Invitrogen	10828-028
L-glutamine		Invitrogen	25020-081
MILLICELL inserts		Millipore	PICM01250
Nonessential Amino Acids		Invitrogen	11140-050
Operating scissors		WPI	501754	General surgery
Paraffin (TissuePrep)		Fisher	8002-74-02
Pen/Strep		Invitrogen	15140-122
Permount		Fisher	SP15-100
PHA		Sigma-Aldrich	L1668
Porcine gelatin		Sigma-Aldrich	G6144
ROCK inhibitor		Calbiochem	Y-27632
SCID beige mice		Charles River	250
Scott’s Wash		Fisher	6697-32	Ricca Chemicals
Vannas spring scissors		WPI	14003	Kidney capsule
β-mercaptoethanol		Sigma-Aldrich	M7522