Teratom Oluşumu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kader Haritalama

Summary

Belirli hücrelerin içine hESC Yönetmen farklılaşma, rejeneratif tıp alanında büyük ilgi yarattı. Biz belirlemek için bir özlü, adım-adım protokolü<em> In vivo</em>, Doku, hücre tabanlı tedavi için özel reaktifler karakterize için çok değerli bir araç sağlar seçilen hESC kaderi.

Abstract

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) için sınırsız bir kendini yenileme kapasitesi ve her üç embriyonik germ (1) türetilen hücrelerin içine ayırt etme yeteneği var. Spesifik hücre tiplerine hESC Yönetmen farklılaşma, rejeneratif tıp alanında (örneğin, (2-5)) çok fazla ilgi ve belirlenmesi için yöntemler vardır<em> In vivo</em> Seçilen ya da manipüle hESC kaderi bu çaba için gerekli. Biz, bu amaç için son derece verimli bir teratom oluşum denemesi adapte var. HESC az sayıda özel olarak seçilmiş, farklılaşmamış vahşi tip hESC ve bir hücre granüle Phaseolus vulgaris lektin ile karıştırılır. Bu immünyetmezligi bir fare böbrek kapsül altında aşılı. 2.5 x 10 gibi az bir⁵ HESC 16 cm oluşturmak için gerekli<sup> 3</sup8-12 hafta içinde teratom. Başlangıçta seçilen hESC kaderi sonra immünohistokimyasal olarak tespit edilebilir. Bu yöntem, doku, hücre tabanlı tedavi için özel reaktifler tanımlamak için değerli bir araç sağlar.

Protocol

Aşağıda yazılı protokol, bazı değişikliklerle birlikte, yazarlar tarafından bildirilen yayınlanmış parametreler üzerine dayanır. Protokol UCSF Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanımı (IACUC) ve Kök Hücre Araştırma Gözetim (SCRO) Komiteleri tarafından onayı ile yapılır. Insan embriyonik kök hücreleri (hESC) I. Kültür Standart 6 (3.5 cm çapında kuyular) plakaları hESC büyütün. Plakalar üzerine besleyici hücrelerin% 1 jelatin (6,7) ile kaplı, en az 12 saat önce hücreleri, tohum fare embriyonik fibroblast (MEF), CF1 gün 1000 Ci az ışınlanmış e12.5 zaman-evlendirilen fareler, elde Pasajlanması. MEFS% 50-60 izdiham, ya da 4 kaplama olmalıdır de 3,5 cm çapına göre x 10 5 hücreleri (Şekil 1). Passage koloniler ~% 70 izdiham (Şekil 2) ulaşmıştır hücreleri. Geçişi için hücreler aspirat KSR büyüme kuyulardan orta (6) ve 0.5 ml orta 1 mg / ml konsantrasyonda KSR kollajenaz IV içeren ile değiştirin. 37 kollajenaz IV plakaları inkübe ° C /% 5, 5 dakika veya koloniler kenarlarına kadar CO 2 plakadan kaldırmaya başlar . Plakadan kollajenaz IV çıkarın, her bir kuyu için 0.5 ml KSR ekleyin ve elle plaka tamamen kaldırmak için hücreleri kazıyın. 15 ml konik bir tüp içinde, her iyi, yerden hücre süspansiyonu toplayın ve hücreleri 5 dakika boyunca ağırlık yerleşmek için izin. ~ 300μl toplam hacmi hücreler ve orta bırakarak, tüpten süpernatantı. Tam hacmi 200 ul mikro-pipet seti kullanarak, hafifçe koloniler break up hücre süspansiyonu 5-6 kez pipetle. Toplam hacim başına 9 ml KSR orta (yani, bir de hasat ise, tüp 9 ml içermelidir) kullanarak hücrelerin orijinal iyi bir hücre süspansiyonu getirin. 12.5 ng / ml 'lik bir konsantrasyon rekombinant insan temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ile orta tamamlayın. Dulbecco'nun fosfat ile MEF hücrelerinin (bkz. adım 2) içeren yeni kuyular yıkandıktan sonra, bütün serum kaldırmak 3 ml hücre süspansiyonu, her bir kuyunun ekleyin ve 37 ° C / 5% CO 2 plakalar inkübe için (DPBS) tuzlu tamponlu . BFGF 24 saat geçtikten sonra ve her 24-48 saat hücreleri yeniden geçişli olarak hazır olana kadar KSR orta değiştirin. II. HESC pelet aşılama için hazırlanması Aşılama öncesi 24 saat 10μM nihai konsantrasyonu, hücre canlılığı artırmak için (8) KSR orta ROCK inhibitörü. ~% 70 izdiham (5 x 10 5 hücreleri) hücreler, böbrek kapsül başına eklenen iki pelet iki pelet yaratacaktır. Aşılama (9) hücre pelletleri hazırlamak için 5 dakika kollajenaz IV ROCK inhibitörü ile tedavi edilen kültürler, 37 ° C /% 5 CO 2 inkübe. Iyi kollajenaz IV aspire edin ve% 10 penisilin / streptomisin (pen / strep) 1 ml DPBS ile değiştirin. El plaka koloniler kazımak ile ek bir kalem / strep 1 ml DPBS iyi durulama ve 1,5 ml mikrofuge'de tüp hücre süspansiyonu her bir 1ml kısım transfer. 8.000 x g kısaca mikrofuge'de tüpler Spin süpernatantı aspirat ve pelet pen / strep 500μl DPBS tekrar süspansiyon. Hücrelerin nakli için bir araya bağlamak yardımcı olmak için, her tüp DPBS içinde 100μl 1 mg / ml Phaseolus vulgaris lektin (PHA) ekleyin. Hücre / PHA süspansiyon oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin, sonra 8.000 x g az 2 dakika boyunca dönerler. Rotor kuyu içinde borular 180 ° döndürün ve 8.000 x g 2 dakika için tekrar döndürün. Süpernatant pelet zedelemeden dikkatlice aspire. Yavaş yavaş yukarı kalkana kadar yavaşça pelet kenarına sonraki 200μl KSR pipetleme tüplerinden hücre pelletleri yerinden oynatın. Bir kez yerinden hemen 3 ml KSR içeren 3.5 cm çapında kuyular yerleştirilir 0.4μm MILLICELL ekler pelet transferi, ve 37 ° C /% 5 CO 2 gece konaklama 2 saat inkübe edin. III. Greft renal kapsül Uygun aseptik teknik kullanılarak kurumsal kurallarına uygun olarak tüm hayvan işlemleri gerçekleştirin. Inhale isoflurane/0.5%% 3 O2 ve intraperitoneal tribromoethanol (25 mg / taze hazırlanmış kg Avertin) bir kombinasyonu kullanılarak, 8-12 hafta arası SCID bej fareler (CB17.Cg Prkdc SCID LYST bg / CRL), narkoz . Farenin başına iki hücre pelletleri açıklanan teknikler kullanarak (10) engrafted olacaktır. Hipotermi önlemek için bir ısıtma yastığı üzerinde fare yerleştirildikten sonra, kesi bölgesi tıraş sonra klorheksidin ile dezenfekte edin. Sadece merkezden cilt ama omurga paralel yoluyla 2,5 cm'lik kesi olun. Steril Salin ile kesi bölgesi nemli tutmake, sadece omurga, kaburga ve yaklaşık 1 cm altında, kas üzerinden küçük bir kesi yapmak. Kesi ile böbrek çekmeye yetecek büyüklükte, ancak kuvvet olmadan böbrek karın boşluğuna geri kayma olmaz bu kadar küçük olmalıdır. Künt, hafif kavisli bir kanca şeklini içine çekti bir bardak Pasteur pipeti kullanarak kas kesiden böbrek yavaşça çekin. Kapsül kurumasını önlemek için steril DPBS böbrek ıslatın. Bu kapsül, çok kırılgan olduğu gibi, işlem boyunca tekrarlamak gerekli olabilir. Dumont # 5 forseps kullanarak hafifçe böbrek kapsülü yukarı çekin ve Vannas yaylı makas kullanılarak 2 mm kesi yapmak. Çok ince, körelmiş bir prob içine çekilmiş olan başka bir cam pipet ile, kapsül ve böbrek arasında küçük bir cep olun. MILLICELL eklemek, tek bir transferi pipet yerleştirilen büyük orifis pipet kullanarak, tek bir hücre pelletini. Fazla medya pelet transferi ile müdahale gibi, mümkün olduğunca birlikte biraz ekstra medya olarak emin olun. Cebine oluşturmak için kesi kenarını tutarken, nazikçe açılması yanında pelet yeri ve tek kutuplu doğru çekti pipet ile böbrek cebine doğru itin. Ikinci bir pelet işlemi tekrarlayın. Bu aynı böbrek kapsülü altında yerleştirin, fakat zıt kutup doğru. Pelet üzerine geri aşağı kapsül dikkatlice yerleştirin. Pelet cebi içinde kalmalıdır ve hiçbir sütür kapsül kapatmak için gereklidir. Böbrek karın boşluğuna yavaşça geri itin ve ekli ters kesme iğne ile 4-0 ipekle (veya daha küçük) kullanarak kas duvarı kapatın. Kesi, sadece tek bir sütür gerekli olduğu kadar küçük olmalıdır. Aynı sütür materyali kullanarak, bir dizi 4-5 kesintiye dikiş cilt kapatın. Fare kendi kafesine yerleştirmeden önce, sırasıyla 0.05 mg / kg buprenorfin (11,12) ve 5 mg / kg Ketoprofen (12,13), kısa vadeli ve uzun vadeli analjezikler olarak yönetmek. Kontrollü maddeler sadece kurumsal kurallarına uygun olarak kullanılmalıdır. Hayvan kendi kafesine geri aktarın ve bir ısıtma yastığı anestezi kurtarmak için izin verir. Bu yaklaşık 20-30 dakika sürer. Fare tam ayaktan sonra, hayvan barınağı tesisi iade edilebilir. IV. Teratom hasat, fiksasyon ve kesit 8-12 hafta ameliyat sonrası, böbrek yakınlarındaki bir zorlukla palpabl teratom olması gerekir. Büyük, içi sıvı dolu kistler genellikle 6-8 hafta başlayan, hem de gelişecektir. Hayvana sıkıntı neden oluyorsa bu bir erken hasat gerekebilir. Teratomlar kistler daha yavaş büyüdüğünden, ancak analiz için yeterli büyüklükte (yani, en az 8 hafta) teratom elde etmek için mümkün olduğunca uzun süre beklemek isteyeceksiniz. Böbrek, teratom ve çevresindeki kistleri, böbrek ilk erişilen aynı cerrahi yaklaşım ile karın boşluğuna doku bir blok olarak herhangi bir çıkarın (bkz. Bölüm III, yukarıdaki adımları 1-4). Eksize edilen doku tüm blok% 10 formalin solüsyonu içeren bir tüp içine yerleştirin. Teratom 4 gece düzeltmek için izin ver ° C Ertesi gün, tüp teratom çıkarın. (Şekil 3) teratom kendisi zarar vermeden, mümkün olduğu kadar herhangi bir kist ve çok böbrek olarak parçalara ayır. Büyük teratomlar diseksiyon ve gömme kolaylaştırmak için yarım kesilebilir. Standart bir parafin fiksasyon tekniği kullanılarak teratom işleyin. Otomatik üniteler (örneğin, Shandon Hypercenter) mevcuttur: I. % 80 Flex alkol 2 saat II. % 80 Flex alkol 1 saat III. % 85 Flex alkol 1.5 saat IV. % 95 Flex alkol 1 saat V. % 100 Flex alkol 1 saat VI. % 100 Flex alkol 1 saat VII. % 100 Flex alkol 1 saat VIII. Clear-Rite 3 1 saat IX. Clear-Rite 3 1 saat X Clear-Rite 3 1 saat </td> XI. Parafin (TissuePrep) 2 saat XII. Parafin (TissuePrep) 2 saat V. İmmünohistokimya ve analiz Bir zamanlar üzerine parafin, slaytlar bölümünde döner mikrotom kullanarak 5μm seri dilimleri teratom ve float bölümleri gömülü. Boyama önce slaytlar, en az bir saat pişirin. Her üç embriyonik germ (Şekil 4) temsilcisi doku yapıları belirlemek için standart yöntemler kullanılarak hematoksilen ve eozin ile slaytlar Leke: I. Ksilen yıkama 3-5 dakika II. Ksilen 3-5 dakika III. % 100 alkol 3-5 dakika IV. % 100 alkol 3-5 dakika V. % 95 alkol 3-5 dakika VI. % 80 alkol 3-5 dakika VII. Suyla yıkayın (çeşitli değişiklikler) 2 dakika VIII. Gül'ün Hematoksilen # 3 2-5 dakika IX. Suyla yıkayın (çeşitli değişiklikler) suyu temiz çalışır kadar X Scott'ın su (mavi çekirdekleri) 3 dakika veya daha fazla XI. Suyla yıkayın (çeşitli değişiklikler) 1-2 dakika XII. Eosin Y 1 dakika XIII. Suyla yıkayın (çeşitli değişiklikler) 30 saniye XIV. % 80 alkol 1 dakika XV. % 95 alkol 2 dakika XVI. % 95 alkol 2 dakika XVII. % 100 alkol 3 dakika XVIII. % 100 alkol (temiz) 3 dakika XIX. Ksilen 2 dakika veya daha fazla XX. Ksilen 2 dakika veya daha fazla Permount her slayt bir lamel monte edin. VI. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1. Kültür farklılaşmamış hESC için besleyici bir katman olarak ışınlanmış CF1 fare embriyonik fibroblastlar Kaplama. MEFS ~% 50 birleştiği noktada yer kaplama, burada gösterildiği gibi, ya da başına 4 x 6 kuyu kültür çanak iyi 3.5 cm çapında 10 5 hücre. Bar, 100 mm. Şekil 2. MEF besleyici tabaka farklılaşmamış hESC akışkan kültür örneği. HESC sonra geçişli olarak tanımlanan, burada görüldüğü gibi, ~% 70 konfluent kadar MEF besleyici katmanlar üzerinde yetiştirilmektedir. Bar, 100 mm. Şekil 3. Eksplante teratomlar Örnek eksplantasyonu ardından, teratom, böbrek ve herhangi bir aksesuar doku formalin bir blok olarak sabit, sonra böbrek ve aksesuar doku dikkatlice parafin içine gömmeden önce kesilmiş bulunmaktadır . Şekil 4. Farklılaşmamış hESC türetilen Teratomlar her üç germ in vivo doku temsilcisi içerir. Teratom, Şekil 3'te gibi embriyonik dokular tespit kesitli ve hematoksilen ve eozin ile boyandı. hESC üç embriyonik germ (ektoderm (A, B), mezoderm (C), endoderm türetilen dokulara doğuran (D). (A) Doğan nöral tüp yapısı. (B) İlkel skuamöz epitel. (C) Kıkırdak yoğunlaştırılmış mezenşimin kapsül ile çevrilidir. (D) Salgı bağırsak yapısı. Bar, 100 mm. Görüntüler yazarın izniyle yeniden basıldı. Şekil 5. Teratom analiz etiketli, farklılaşmamış hESC kaderi eşlemek için kullanılır. Daha önce yayınlanmış gibi (9), ile özel etiketli etiketsiz hESC hESC bir karışım teratom oluşum denemesi etiketli hücrelerinin kaderi harita için kullanılabilir. Burada gösterildiği gibi, yüzey işaretleyici, CD133, ve gelişmiş yeşil flüoresan protein (eGFP) etiketli ifade farklılaşmamış hESC etiketsiz, farklılaşmamış hESC ile karıştırıldı. Bu aşılama renal kapsül tarafından teratomlar oluşturmak için kullanılır. Anti-eGFP antikoru ile immünohistokimyasal analizi, hematoksilen ve eozin lekeli teratom bölümleri CD133 + hESC nöroektodermal kaderi gösteriyor. Teratomlar Şekil 4 gibi işlenmiş ve dokular içinde CD133 + GFP + hücreler türevleri lokalize anti-eGFP antikor (kahverengi) ile zıt. CD133 + elde edilen hücreler (ok) embriyonik ektoderm, özellikle sinir epiteli (solda) ve doğmakta olan nöral tüp benzeri yapılar (sağda) kaynaklanan dokularda gözlendi . Bar, 100 mm. Görüntüler yazarın izniyle yeniden basıldı. Jelâtin % 0,1 'Domuz jelatin % 99.9 DPBS 37 ° C (0.22μm) bir saat veya tüm jelatin solüsyonu içine girene kadar, ve sterilize kullanmadan önce inkübe DPBS, jelatin ekleyin. MEF orta % 10 fetal sığır serumu (Nitelikli) % 90 Dulbecco'nun (D-MEM) Esansiyel Orta Modifiye bulunuyor 1x L-Glutamine 1x Pen / Strep Kullanımdan önce sterilize Filtre. KSR (Knockout Serum Değiştirme) orta % 20 nakavt Serum Değiştirme % 80 nakavt D-MEM 1x L-Glutamine 1x gerekli olmayan Amino Asitler 0.1 mM β-mercaptoethanol / 12.5 ng / ml bFGF Sterilize Filtresi. 37 ° C, ama sıcak ° C hücrelere eklemeden önce 4 saklayın. BFGF kullanımdan hemen önce ekleyin. Kollajenaz IV. 1 mg / ml KSR ortamda tüm toz çözüm girene kadar 1-2 saat ya da 37 ° C yerleştirerek eritin. Sterilize Filtresi. Avertin 0,25 g 2,2,2-tribromoethanol 0.25 ml 2-metil-2-bütanol 37 ° ° C'de% 100 çözüm oluşturmak için bir gecede. Ameliyat öncesi birkaç saat, 37 DPBS ve inkübe kullanarak sulandırmak için% 2,5 'çalışma çözüm ° C en az 1 saat. Kısım sterilize ve Filtre. Tribromoethanol yüksek ışığa duyarlı hazırlanması ve kullanımının her aşamasında, bu yüzden ışıktan korur. Kullanmadan önce 12-24 saatten fazla hazırlayın. Buprenorfin Metanol içinde 1 mg / ml stok solüsyonu 0.015 mg / ml steril H 2 O. kullanarak çalışma çözeltisi ile seyreltilir 1 aya kadar -20 ° C'de saklayın. Ketoprofen DPBS 0.5 mg / ml çalışma çözeltisi DPBS 37 o gecede inkübe ° C'de 1-2 saat veya tüm toz çözüm içine girene kadar. Sterilize Filtre ve 4 saklamak ° C

Discussion

Biz, in vivo ortamda bir hESC ayırt kaderi haritalama amaç için son derece verimli teratom oluşum denemesi adapte var. HESC az sayıda özel olarak seçilmiş, farklılaşmamış vahşi tip hESC ve bir hücre granüle Phaseolus vulgaris lektin ile karıştırılır. Bu immünyetmezligi bir fare böbrek kapsül altında aşılı. Başlangıçta seçilen hESC kaderi immünohistokimya tarafından belirlenir (Şekil 5), daha önce de bildirilmiştir (9). Bu yöntem, doku, hücre tabanlı tedavi için özel reaktifler belirlenmesi ve üretmek için değerli bir araç sağlar.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
2-Methyl-2-butanol		Sigma-Aldrich	240486	Avertin
2,2,2-Tribromoethanol		Sigma-Aldrich	T48402	Avertin
4-0 silk sutures		Ethicon	641G
bFGF		R&D Systems	233FB
Buprenorphine		Sigma-Aldrich	B7536
Clear-Rite 3		Fisher	22-046-341
Collagenase IV		Sigma-Aldrich	C5138
D-MEM		Invitrogen	11965
DPBS		Invitrogen	14190
Dupont #5 forceps		WPI	500233	Kidney capsule
Eosin Y		Fisher	23-245-658
Fetal Bovine Serum (Qualified)		Invitrogen	26140-079
Flex alcohol		Fisher	22-046344
Gill’s Hematoxylin #3		Fisher	22-050-204
Hemostat, straight		WPI	501241	General surgery
Iris forceps		WPI	15914	General surgery
Ketoprofen		Sigma-Aldrich	K2012
KnockOut D-MEM		Invitrogen	10829
KnockOut Serum Replacement		Invitrogen	10828-028
L-glutamine		Invitrogen	25020-081
MILLICELL inserts		Millipore	PICM01250
Nonessential Amino Acids		Invitrogen	11140-050
Operating scissors		WPI	501754	General surgery
Paraffin (TissuePrep)		Fisher	8002-74-02
Pen/Strep		Invitrogen	15140-122
Permount		Fisher	SP15-100
PHA		Sigma-Aldrich	L1668
Porcine gelatin		Sigma-Aldrich	G6144
ROCK inhibitor		Calbiochem	Y-27632
SCID beige mice		Charles River	250
Scott’s Wash		Fisher	6697-32	Ricca Chemicals
Vannas spring scissors		WPI	14003	Kidney capsule
β-mercaptoethanol		Sigma-Aldrich	M7522