迅速な方法は、細胞外マトリックス中の多糖類の構造についての洞察を得るために説明されています。方法はglycosylhydrolasesの特異性と材料の微量を分析できるように質量分析の感度を利用しています。この手法は、組織自体に直接使用するための適応です。
環境への細胞の直接接触は、細胞外マトリックスによって多くの生物に仲介されている。細胞外マトリックスの一つの一般的な側面は、彼らは複雑な糖の糖タンパク質の形で部分、プロテオグリカン、および/または多糖類を含んでいるということです。例としては、繊維状のタンパク質およびプロテオグリカンや植物と菌類の多糖類ベースの細胞壁を主とする人間と動物細胞の細胞外マトリックス、プロテオグリカン/細菌の糖脂質ベースの細胞壁が含まれています。すべてのこれらのglycostructuresは、細胞間および細胞 – 環境コミュニケーションとシグナル伝達において重要な役割を果たしている。
細胞外マトリックスの異常な複雑な例では、高等植物の細胞壁に存在しています。その壁は、最大75%乾燥重量に、糖からほとんど完全に成って、そしてこの地球上に存在する最も豊富に存在する生体高分子から構成されています。したがって、研究は化石燃料から得られる石油化学製品を置き換えるために、カーボンニュートラルな再生可能資源として最適なこれらの材料を活用する方法を実施しています。燃料転換のための主な課題は、このユニークなbiocompositeに存在するユニークなglycostructuresによる酵素的または化学的劣化に壁の反抗のまま。
ここで、我々は、植物細胞壁のglycostructuresの迅速かつ高感度分析法を提示する。このメソッドオリゴマスプロファイリング(オリンプは)特定のglycosylhydrolasesとマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF/MSを用いて可溶化したオリゴ糖混合物のその後の分析を容易にする壁材料からのオリゴ糖の酵素のリリースをベースにしています1)(図1)。オリンプは、完全な分析のためにのみ5000細胞の壁は、組織自体が2で実行できる必要があり、ハイスループット分析3に従順です。可溶化されたオリゴ糖の絶対量がオリンプによって決定することはできませんが、様々なオリゴ糖のイオンの相対量は、壁に存在する天然多糖の置換パターンについての洞察を与えるマススペクトルから線引きすることができます。
オリンプは、特定の酵素4の可用性によって制限壁ポリマー、多種多様な分析をするために使用することができます。例えば、植物細胞壁の酵素に存在するポリマーの分析のためにエンド -β-(1-4)-キシラナーゼ6,7を使用してキシログルカナーゼ5、11、12、13、キシランを用いたヘミセルロースのキシログルカンを分析するために用意されています、またはポリガラクツロナーゼおよびメチルエステラーゼ8の組み合わせを使用して、ペクチン多糖類のため。さらに、オリンプglycosylhydrolaseとさえ糖転移酵素活性のと同じ原理を使用しては監視し、9を決定することができます。
ここで紹介するオリンプ方法は、細胞外マトリックスに存在するポリマーの非常に敏感かつ迅速な分析が可能になります。オリンプは、後続のMALDI – TOF分析とオリゴマーの酵素的放出を兼ね備えています。 MALDI – TOFスペクトルの生成は、1分未満を受け取り、それ故にオリンプは、このような変異体の画面のようなハイスループット試験を含む広範囲のアプリケーションに適しています。オリンプは、植物の多糖類に限定されるものではなく、潜在的にのみ特異的加水分解酵素の利用可能性によって制限ポリマー、の広い範囲に適用することができます。しかし、オリンプの制限は、ポリマーの絶対的な豊かさが得られないということです。
オリンプが種の多様性の細胞外マトリックスに存在する多糖類の様々の構造を研究するために使用する前に、前述のとおり。例として、図4は、草種の主要なヘミセルロース、キシランのオリンプスペクトルを表しています。ここでは、温帯草ススキ由来の細胞壁の材料は、キシラナーゼを用いて消化した。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、エネルギーバイオサイエンス研究所の助成金OO0G01によって賄われていた。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 37550 | 10mg/mL in water | |
BioRex MSZ 501(D) Resin | BioRad | 142-7425 | ||
Endoglucanase | Megazyme | E-CELTR | ||
Xylanase M6 | Megazyme | E-XYRU6 | ||
3mm metal balls | Retsch | 22.455.0011 | ||
Beat mill | Retsch | Mixer Mill MM400 | ||
MALDI-TOF | Shimadzu BioTech | Axima Performance | ||
MALDI target plate | Kratos Analytical | DE4555TA | ||
SpeedVac | Eppendorf | Vacufuge 5301 | ||
Vacuum manifold | Millipore | MSVMHTS00 | ||
Vacuum pump | Welch | DryFast Ultra 2032 |