Een snelle manier is beschreven om inzicht te krijgen in de structuur van de polysacchariden in een extracellulaire matrix. De methode maakt gebruik van de specificiteit van glycosylhydrolases en de gevoeligheid van massaspectrometrie waarmee minieme hoeveelheden van de materialen worden geanalyseerd. Deze techniek is aan te passen aan direct worden gebruikt op weefsel zelf.
Het directe contact van de cellen aan de omgeving wordt bemiddeld in veel organismen door een extracellulaire matrix. Een veel voorkomende aspect van de extracellulaire matrices is dat ze complexe suikers groepen in de vorm van glycoproteïnen, proteoglycanen, en / of polysacchariden bevatten. Voorbeelden hiervan zijn de extracellulaire matrix van mensen en dierlijke cellen voornamelijk bestaande uit fibrillair eiwitten en proteoglycanen of de polysaccharide gebaseerde celwanden van planten en schimmels, en de proteoglycan / glycolipide op basis van de celwanden van bacteriën. Al deze glycostructures spelen een belangrijke rol in cel-cel en cel-tot-omgeving communicatie en signalering.
Een buitengewoon complex voorbeeld van een extracellulaire matrix aanwezig is in de muren van hogere planten. Hun muur is bijna helemaal gemaakt van suikers, tot 75% droog gewicht, en bestaat uit de meest voorkomende biopolymeren aanwezig zijn op deze planeet. Daarom wordt onderzoek gedaan hoe deze materialen best te gebruiken als een koolstof-neutrale hernieuwbare grondstof voor petrochemische producten afgeleid van fossiele brandstoffen te vervangen. De belangrijkste uitdaging voor brandstof conversie blijft de weerspannigheid van de muren om enzymatische of chemische degradatie als gevolg van de unieke glycostructures aanwezig zijn in dit unieke biocomposite.
Hier presenteren we een methode voor de snelle en gevoelige analyse van plantaardige celwand glycostructures. Deze methode Oligo Mass Profiling (Olimp) is gebaseerd op de enzymatische release van oligosachariden uit wandmaterialen faciliteren specifieke glycosylhydrolases en daaropvolgende analyse van het opgeloste oligosaccharide mengsels met behulp van matrix-assisted laser desorptie / ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF/MS ) 1 (figuur 1). Olimp vereist muren van slechts 5000 cellen voor een volledige analyse, kunnen worden uitgevoerd op het weefsel zelf 2, en vatbaar is voor high-throughput-analyses 3. Hoewel het absolute bedrag van de opgeloste oligosacchariden niet kan worden bepaald door Olimp de relatieve overvloed van de verschillende oligosaccharide ionen kunnen worden afgebakend van de massa spectra geeft inzichten over het substitutie-patroon van de inheemse polysaccharide aanwezig is in de muur.
Olimp kan worden gebruikt om een breed scala aan wand-polymeren, alleen beperkt door de beschikbaarheid van specifieke enzymen 4 te analyseren. Bijvoorbeeld, voor de analyse van polymeren in de plant aanwezige celwand enzymen beschikbaar zijn voor de hemicellulose xyloglucan met behulp van een xyloglucanase 5, 11, 12, 13, xylaan met behulp van een endo-β-(1-4)-xylanase 6,7 analyseren , of voor pectinestoffen polysacchariden met behulp van een combinatie van een polygalacturonase en een methylesterase 8. Bovendien kan met behulp van dezelfde principes van Olimp glycosylhydrolase en zelfs glycosyltransferase activiteiten worden gecontroleerd en vastgesteld 9.
De hier gepresenteerde methode Olimp maakt een zeer gevoelige en snelle analyse van polymeren in de extracellulaire matrices. Olimp combineert de enzymatische release van oligomeren met latere MALDI-TOF-analyse. Het genereren van een MALDI-TOF spectrum duurt minder dan een minuut, vandaar Olimp is geschikt voor een breed scala aan toepassingen, waaronder high-throughput studies zoals mutant schermen. Olimp is niet beperkt tot plant polysacchariden, maar kan mogelijk worden toegepast op een breed scala aan polymeren, alleen beperkt door de beschikbaarheid van specifieke hydrolytische enzymen. Echter, een beperking van Olimp is dat een absolute rijkdom van het polymeer niet kan worden verkregen.
Zoals eerder vermeld Olimp kan worden gebruikt om de structuur van een verscheidenheid aan polysacchariden aanwezig zijn in de extracellulaire matrix van een diversiteit van soorten te bestuderen. Als voorbeeld, Figuur 4 geeft een Olimp spectrum van de belangrijkste hemicellulose in grassoorten, xylaan. Hier was celwand materiaal afkomstig van de gematigde gras Miscanthus verteerd met behulp van een xylanase.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door het Energy Biosciences Institute de subsidie OO0G01.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 37550 | 10mg/mL in water | |
BioRex MSZ 501(D) Resin | BioRad | 142-7425 | ||
Endoglucanase | Megazyme | E-CELTR | ||
Xylanase M6 | Megazyme | E-XYRU6 | ||
3mm metal balls | Retsch | 22.455.0011 | ||
Beat mill | Retsch | Mixer Mill MM400 | ||
MALDI-TOF | Shimadzu BioTech | Axima Performance | ||
MALDI target plate | Kratos Analytical | DE4555TA | ||
SpeedVac | Eppendorf | Vacufuge 5301 | ||
Vacuum manifold | Millipore | MSVMHTS00 | ||
Vacuum pump | Welch | DryFast Ultra 2032 |