Un modo rapido per guadagnare è descritto lo studio della struttura di polisaccaridi in una matrice extracellulare. Il metodo sfrutta la specificità del glycosylhydrolases e la sensibilità della spettrometria di massa permette piccole quantità di materiale da analizzare. Questa tecnica è adattabile per essere utilizzato direttamente sul tessuto stesso.
Il contatto diretto delle cellule con l'ambiente è mediato in molti organismi da una matrice extracellulare. Un aspetto comune delle matrici extracellulari è che essi contengono frazioni di zuccheri complessi in forma di glicoproteine, proteoglicani, e / o polisaccaridi. Alcuni esempi sono la matrice extracellulare degli esseri umani e cellule animali che consistono principalmente di proteine fibrillari e proteoglicani o la base di polisaccaridi pareti delle cellule delle piante e funghi, e il proteoglicani / glicolipide pareti cellulari a base di batteri. Tutti questi glycostructures giocano un ruolo fondamentale nella cellula-cellula e comunicazione cellula-ambiente e di segnalazione.
Un esempio straordinario complesso di una matrice extracellulare è presente nelle pareti delle cellule delle piante superiori. Il loro muro è fatto quasi interamente di zuccheri, fino al 75% del peso secco, e consiste nella più abbondanti biopolimeri presenti su questo pianeta. Pertanto, la ricerca è condotta come utilizzare questi materiali migliori come carbon-neutral delle risorse rinnovabili in sostituzione di prodotti petrolchimici derivati da combustibili fossili. La sfida principale per la conversione del carburante rimane la riluttanza dei muri per degradazione enzimatica o chimica a causa della glycostructures unici presenti in questo biocomposite unico.
Qui, vi presentiamo un metodo per l'analisi rapida e sensibile di glycostructures cellula vegetale muro. Questo metodo di analisi di massa oligo (OLIMP) si basa il rilascio enzimatica di oligosaccaridi da facilitare glycosylhydrolases Pareti di materiali specifici e successiva analisi delle miscele solubilizzato oligosaccaridi utilizzando matrice laser assistita desorbimento / ionizzazione tempo di volo spettrometria di massa (MALDI-TOF/MS ) 1 (Figura 1). OLIMP richiede pareti delle celle solo 5000 per una analisi completa, può essere effettuata sul tessuto stesso 2, ed è suscettibile di high-throughput analisi 3. Mentre la quantità assoluta dei oligosaccaridi solubilizzato non può essere determinata da OLIMP l'abbondanza relativa degli ioni vari oligosaccaridi possono essere delineate dagli spettri di massa dando intuizioni circa la sostituzione-pattern del polisaccaride nativo presente nel muro.
OLIMP può essere utilizzato per analizzare una vasta gamma di polimeri muro, limitato solo dalla disponibilità di enzimi specifici 4. Ad esempio, per l'analisi dei polimeri presenti nei enzimi vegetali della parete cellulare sono disponibili per analizzare i xyloglucan emicellulose utilizzando un xyloglucanase 5, 11, 12, 13, xilano utilizzando un endo-β-(1-4) xilanasi 6,7 , o per polisaccaridi pectiche utilizzando una combinazione di una poligalatturonasi e un methylesterase 8. Inoltre, utilizzando gli stessi principi di OLIMP glycosylhydrolase e anche attività glicosiltransferasi possono essere monitorati e determinato 9.
Il metodo OLIMP qui presentata consente una analisi molto sensibile e rapida dei polimeri presenti nelle matrici extracellulari. OLIMP combina il rilascio enzimatico di oligomeri con successiva analisi MALDI-TOF. La generazione di un MALDI-TOF spettro richiede meno di un minuto, quindi OLIMP è adatto per una vasta gamma di applicazioni, tra high-throughput studi come schermi mutante. OLIMP non si limita ai polisaccaridi vegetali, ma può potenzialmente essere applicato a una vasta gamma di polimeri, limitato solo dalla disponibilità di specifici enzimi idrolitici. Tuttavia, una limitazione di OLIMP è che l'abbondanza assoluta del polimero non può essere ottenuto.
Come accennato prima OLIMP può essere usato per studiare la struttura di una varietà di polisaccaridi presenti nella matrice extracellulare di una diversità di specie. A titolo di esempio, la Figura 4 rappresenta uno spettro OLIMP della emicellulosa principali specie di erba, xilano. Qui, parete materiale cellulari derivate da l'erba Miscanthus temperato è stato digerito con un nasi.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato dalla Energy Biosciences Institute concedere OO0G01.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 37550 | 10mg/mL in water | |
BioRex MSZ 501(D) Resin | BioRad | 142-7425 | ||
Endoglucanase | Megazyme | E-CELTR | ||
Xylanase M6 | Megazyme | E-XYRU6 | ||
3mm metal balls | Retsch | 22.455.0011 | ||
Beat mill | Retsch | Mixer Mill MM400 | ||
MALDI-TOF | Shimadzu BioTech | Axima Performance | ||
MALDI target plate | Kratos Analytical | DE4555TA | ||
SpeedVac | Eppendorf | Vacufuge 5301 | ||
Vacuum manifold | Millipore | MSVMHTS00 | ||
Vacuum pump | Welch | DryFast Ultra 2032 |