Chromatin परख सक्रिय मानव कोशिकाओं में जीन एक्सप्रेशन में गतिशील histone संशोधन करने के लिए immunoprecipitation (चिप)
Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे chromatin immunoprecipitation (चिप) chromatin टेम्पलेट है कि एक संकेत transduction मार्ग से प्रेरित प्रतिलेखन विनियमित करने के लिए गतिशील परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
Abstract
कोशिकी ligands की एक किस्म के जवाब में, स्टेट (संकेत और प्रतिलेखन के transducer उत्प्रेरक) प्रतिलेखन कारक तेजी से कोशिका की सतह रिसेप्टर्स जहां वे phosphorylation द्वारा एक एकल एक tyrosine अवशेषों पर सक्रिय कर रहे हैं के लिए कर रहे हैं उनके cytoplasm में अव्यक्त राज्य से भर्ती है. वे तो dimerize और नाभिक को टसकाना लक्ष्य जीन प्रतिलेखन ड्राइव, विकास, भेदभाव, homeostasis और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को प्रभावित. आश्चर्य नहीं कि उनके सामान्य कोशिका प्रक्रिया में व्यापक भागीदारी को देखते हुए, स्टेट समारोह की dysregulation मानव रोग के लिए योगदान देता है विशेष रूप से 2 कैंसर और autoimmune बीमारियों 3.
यह अच्छी तरह से स्थापित है कि प्रतिलेखन परिवर्तन द्वारा chromatin 4,5 टेम्पलेट के लिए विनियमित है. ये परिवर्तन एटीपी निर्भर परिसरों, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सहसंयोजक histone संशोधनों और डीएनए मेथिलिकरण 6 की गतिविधियों में शामिल हैं. क्योंकि जीन अभिव्यक्ति के स्टेट सक्रियण दोनों तेजी से और क्षणिक है, यह modulating स्टेट निर्भर जीन loci में chromatin टेम्पलेट के लिए विशिष्ट तंत्र की आवश्यकता है. इन तंत्रों को परिभाषित करने के लिए, हम histone संशोधनों और enzymatic गतिविधियों है कि उन्हें जीन loci कि स्टेट संकेत के लिए जवाब में उत्पन्न विशेषताएँ. इस प्रोटोकॉल chromatin immunoprecipitation, एक तरीका है कि स्टेट सक्रिय जीन अभिव्यक्ति में chromatin संकेत के अध्ययन के लिए मूल्यवान है का वर्णन करता है.
Protocol
Discussion
चिप उल्लिखित प्रोटोकॉल बीस से अधिक विभिन्न histone संशोधनों की परख के लिए प्रयोगशाला में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया. इसके अलावा, हम प्रतिलेखन कारकों के अधिभोग में परिवर्तन की विशेषता है, histone संशोधित एं?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम वर्जीनिया विश्वविद्यालय, वर्जीनिया कैंसर केंद्र के विश्वविद्यालय और थॉमस एफ और केट मिलर Jeffress मेमोरियल ट्रस्ट द्वारा समर्थित है. हम जेम्स ई. Darnell लैब (रॉकफेलर विश्वविद्यालय) रॉबर्ट रॉस लैब (Fordham विश्वविद्यालय) सेल लाइनों के लिए धन्यवाद.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 37% Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | ||
| Chloroform/Isoamyl alcohol | Acros | AC32715-5000 | ||
| Complete Mini Protease Inhibitors | Roche | 1836153 | ||
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04N | ||
| DMEM | Hyclone | SH30243 | ||
| DTT | Sigma | D0632 | ||
| EDTA | Fisher | BP118-500 | ||
| Ethanol | Pharmco | zp1110EP | ||
| Glycine | Roche | 100149 | ||
| Glycogen | Roche | 901393 | ||
| HEPES | Sigma | H3784 | ||
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | ||
| IgG | Jackson Immunoresearch |
109-005-003 |
||
| KCl | MP Biologicals | |||
| LiCl | Sigma | L4408 | ||
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ||
| Sodium Acetate | Fisher | BP333-500 | ||
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | Fisher | BP349-100 | ||
| NaCl | Fisher | 7647-14-5 | ||
| NP40 | US Biological | N3500 | ||
| Anti-Histone H3, CT, pan | Millipore | 07-690 | ||
| Phenol/chloroform/isoamyl | Fisher | 108-95-2 | ||
| Phosphate Buffered Saline | Fisher | 7647-14-5 | ||
| PMSF | EMD | 50-230-0316 | ||
| Proteinase K | 5-Prime | 2500140 | ||
| RNAse A | 5-Prime | 2500130 | ||
| Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose | Millipore | 16-157 | ||
| Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse | Millipore | 16-201 | ||
| SDS | Fisher | BP166-500 | ||
| Tris-Cl | Sigma | T5941 | ||
| Triton X-100 | Acros | 327372500 | ||
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | ||
| Anti-STAT1 | Santa Cruz | sc-345X | ||
| Anti-RNA Polymerase II | Santa Cruz | sc-899 |
References
- Levy, D., Darnell, J. E. Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).
- Bromberg, J., Darnell, J. E. The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function. Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).
- Hu, X., Ivashkiv, L. B. Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases. Immunity. 31, 539-550 (2009).
- Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
- Kouzarides, T. Chromatin Modifications and Their Function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).
- Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).
- Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. Activities of IRF-1. J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).
- Ross, R. A., Spengler, B. A. Human neuroblastoma stem cells. Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).
