Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour doser modification des histones dynamique dans l'expression génique dans les cellules humaines Activé

Summary

Ce protocole décrit comment la chromatine immunoprécipitation (ChIP) est utilisée pour étudier les altérations dynamiques du modèle de la chromatine qui régulent la transcription induite par une voie de transduction du signal.

Abstract

En réponse à une variété de ligands extracellulaires, la STAT (transducteur de signal et activateur de la transcription) des facteurs de transcription sont rapidement recrutés dans leur état ​​latent dans le cytoplasme aux récepteurs de surface cellulaire où ils sont activés par la phosphorylation d'un seul résidu tyrosine ^1. Ils ont ensuite dimériser et translocation vers le noyau de conduire la transcription de gènes cibles, affectant la croissance, la différenciation, l'homéostasie et la réponse immunitaire. Il n'est pas surprenant, étant donné leur implication dans les processus généralisé de cellules normales, dérèglement de la fonction STAT contribue à la maladie humaine, en particulier pour les cancers et les maladies auto-immunes ^{2 3.}

Il est bien établi que la transcription est régulée par des modifications au modèle de la chromatine ^4,5. Ces modifications comprennent les activités de l'ATP-dépendant de complexes, ainsi que covalentes modifications des histones et la méthylation de l'ADN ^6. Parce que l'activation de l'expression génique STAT est à la fois rapide et transitoire, elle nécessite des mécanismes spécifiques permettant de moduler le modèle chromatine au locus du gène STAT-dépendante. Pour définir ces mécanismes, nous caractérisons les modifications des histones et les activités enzymatiques qui les génèrent à des loci génétiques qui répondent à STAT. Ce protocole décrit immunoprécipitation de la chromatine, une méthode qui est précieux pour l'étude de la STAT à la chromatine dans l'expression des gènes activés.

Protocol

PLANIFICATION

La veille d'une expérience de ChIP est prévu, les cellules doivent être cultivées de sorte qu'un nombre suffisant est disponible. Supposons que chaque dosage, il faudra ChIP ~ 1 à 1,5 x 10 ⁷ cellules. Prévoyez toujours de faire les deux contrôles négatifs (IgG) et positifs (anticorps pan histones) et des expériences en double.
Astuce - Pour les cellules 2FTGH, chaque dosage puce nécessite environ une boîte de culture 15 cm de tissu à 80% de confluence.

PARTIE 1: PRÉPARER ET EFFECTUER CHROMATINE ChIP

1. Retirez les milieux de culture et d'induire les cellules....

Discussion

Le protocole décrit ChIP a été utilisé avec succès dans le laboratoire d'essai de plus de vingt différentes modifications des histones. En outre, nous avons caractérisé les changements dans l'occupation des facteurs de transcription, enzymes de modification des histones, protéines qui reconnaissent modifications des histones et la transcription de l'ARN polymérase II machines, à l'IFN-γ de plusieurs gènes induits. Nous avons également utilisé la procédure de caractériser les changements dans les modifica.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
37 % Formaldéhyde	Fisher Scientific	BP531-500
Alcool chloroforme/isoamylique	Acros Organics	AC32715-5000
Mini inhibiteurs complets de la protéase	Roche Group	1836153
Cosmic Calf Serum	Hyclone	SH30087.04N
DMEM	Hyclone	SH30243
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500
Éthanol	Pharmco Products, Inc.	zp1110EP
Glycine	Groupe Roche	100149
Glycogène	Roche Groupe	901393
HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
IFN-gamma	R& D Systems	285-IF-100
IgG	Jackson ImmunoResearch	109-005-003
KCl	MP Biomedicals
LiCl	Sigma-Aldrich	L4408
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
Acétate de sodium	Fisher Scientific	BP333-500
désoxycholique Sel de sodium acide	Fisher Scientific	BP349-100
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5
NP40	US Biological	N3500
Anti-histone H3, CT, pan	EMD Millipore	07-690
Phénol/chloroforme/isoamyle	Fisher Scientific	108-95-2
Saline tamponnée au phosphate	Fisher Scientific	7647-14-5
PMSF EMD	Millipore	50-230-0316
Protéinase K	5 PRIME	2500140
ARNASE A	5 PRIME	2500130
Spermatozoïde de saumon ADN/Protéine A Agarose	EMD Millipore	16-157
Spermatozoïde de saumon ADN/Protéine G Agaorse	EMD Millipore	16-201
FDS	Fisher Scientific	BP166-500
Tris-Cl	Sigma-Aldrich	T5941
Triton X-100	Acros Organics	327372500
Anti-K36me3	Abcam	ab9050
Anti-STAT1	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-345X
Anti-ARN Polymérase II	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-899