Kromatin Immunoprecipitation (chip) för analys Dynamisk Histon Ändring i aktiverade genuttryck i humana celler
Summary
Detta protokoll beskriver hur kromatin immunoprecipitation (chip) används för att studera dynamiska förändringar i kromatin mall som reglerar transkription inducerad av en signaltransduktion väg.
Abstract
Som svar på en mängd extracellulär ligander transkriptionsfaktorer STAT (signal givare och aktivator av transkription) snabbt rekryteras från sitt latenta tillstånd i cytoplasman till receptorer på cellens yta där de aktiveras av fosforylering på en enda tyrosin rester 1. De sedan dimerize och translocate till kärnan för att driva transkriptionen av mål gener, som påverkar tillväxt, differentiering, homeostas och immunförsvaret. Inte överraskande, med tanke på deras omfattande engagemang i cellens normala processer bidrar oregelbundenhet i STAT funktion till mänskliga sjukdomar, särskilt cancer 2 och autoimmuna sjukdomar 3.
Det är välkänt att transkription styrs av förändringar i kromatin mallen 4,5. Dessa förändringar omfattar verksamheten i ATP-beroende komplex, liksom kovalenta histon modifieringar och DNA-metylering 6. Eftersom STAT aktivering av genuttryck är både snabba och övergående, det kräver särskilda mekanismer för modulerande kromatinet mall på STAT-beroende genen loci. För att definiera dessa mekanismer, karakteriserar vi histon ändringar och den enzymatiska aktiviteter som genererar dem i gen-loci som svarar på STAT signalering. Detta protokoll beskriver kromatin immunoprecipitation, en metod som är värdefull för studier av STAT signalering till kromatin i aktiverade genuttryck.
Protocol
Discussion
Chip protokoll som beskrivs har använts framgångsrikt i labbet för att analysen mer än tjugo olika histon ändringar. Dessutom har vi präglat förändringar i beläggning av transkriptionsfaktorer, histon-enzym, proteiner som känner igen histon ändringar och RNA-polymeras II transkription maskiner på flera IFN-γ inducerade gener. Vi har också använt förfarandet för att karakterisera förändringar i histon modifieringar under differentiering av en cancer stamceller 10.
<p class="jove_content"…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av University of Virginia, University of Virginia Cancer Center och Thomas F. och Kate Miller Jeffress Memorial Trust. Vi tackar James E. Darnell Lab (Rockefeller University) Robert Ross Lab (Fordham University) för cellinjer.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 37% Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | ||
| Chloroform/Isoamyl alcohol | Acros | AC32715-5000 | ||
| Complete Mini Protease Inhibitors | Roche | 1836153 | ||
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04N | ||
| DMEM | Hyclone | SH30243 | ||
| DTT | Sigma | D0632 | ||
| EDTA | Fisher | BP118-500 | ||
| Ethanol | Pharmco | zp1110EP | ||
| Glycine | Roche | 100149 | ||
| Glycogen | Roche | 901393 | ||
| HEPES | Sigma | H3784 | ||
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | ||
| IgG | Jackson Immunoresearch |
109-005-003 |
||
| KCl | MP Biologicals | |||
| LiCl | Sigma | L4408 | ||
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ||
| Sodium Acetate | Fisher | BP333-500 | ||
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | Fisher | BP349-100 | ||
| NaCl | Fisher | 7647-14-5 | ||
| NP40 | US Biological | N3500 | ||
| Anti-Histone H3, CT, pan | Millipore | 07-690 | ||
| Phenol/chloroform/isoamyl | Fisher | 108-95-2 | ||
| Phosphate Buffered Saline | Fisher | 7647-14-5 | ||
| PMSF | EMD | 50-230-0316 | ||
| Proteinase K | 5-Prime | 2500140 | ||
| RNAse A | 5-Prime | 2500130 | ||
| Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose | Millipore | 16-157 | ||
| Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse | Millipore | 16-201 | ||
| SDS | Fisher | BP166-500 | ||
| Tris-Cl | Sigma | T5941 | ||
| Triton X-100 | Acros | 327372500 | ||
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | ||
| Anti-STAT1 | Santa Cruz | sc-345X | ||
| Anti-RNA Polymerase II | Santa Cruz | sc-899 |
References
- Levy, D., Darnell, J. E. Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).
- Bromberg, J., Darnell, J. E. The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function. Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).
- Hu, X., Ivashkiv, L. B. Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases. Immunity. 31, 539-550 (2009).
- Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
- Kouzarides, T. Chromatin Modifications and Their Function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).
- Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).
- Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. Activities of IRF-1. J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).
- Ross, R. A., Spengler, B. A. Human neuroblastoma stem cells. Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).
