O método IP-FCM é apresentado, o que permite uma sensível, avaliação, robusto bioquímica de espécies nativas interações proteína-proteína, sem a necessidade de engenharia genética ou grandes amostras.
Imunoprecipitação detectada por citometria de fluxo (IP-FCM) é um método eficiente para a detecção e quantificação de interações proteína-proteína. O princípio básico que se estende de ELISA sanduíche, onde o analito capturado primária pode ser detectado em conjunto com outras moléculas associadas fisicamente dentro de complexos multiprotein. O procedimento envolve o acoplamento covalente de microesferas de látex de poliestireno com immunoprecipitating anticorpos monoclonais (mAb) específico para uma proteína de interesse, incubando estas contas com lisados celulares, sondagem complexos de proteína capturadas com fluorocromo-sondas, e análise de talão associado fluorescência por citometria de fluxo. FCM-IP é extremamente sensível, permite a análise de proteínas em sua nativa (não-desnaturado) do estado, e é passível de qualquer análise semi-quantitativa ou quantitativa. Como vantagens adicionais, IP-FCM não requer engenharia genética ou equipamentos especializados, além de um citômetro de fluxo, e pode ser facilmente adaptado para aplicações de alto rendimento.
Informações sobre interações proteína-proteína é altamente relevante para a análise de muitos processos celulares, tais como transdução de sinal, a maturação linhagem, progressão do ciclo celular, apoptose e cascatas. FCM-IP oferece uma maneira rápida, quantitativa e sensíveis para analisar a interação de proteínas e definir os membros de complexos multiprotein em sua conformação nativa. Esferas podem ser acoplados e incubadas com lisados celulares em um dia e pode ser sondado e analisadas no dia seguinte. Um formato de placa de 96 poços permite um grande número de amostras a serem analisadas de uma só vez para a coleta de dados eficiente para fins estatísticos ou de triagem. Usando fluorescentes padrões talão, o número de proteínas capturados por cada talão pode ser estimada. Muito pouco material de origem é necessária para a captura e detecção, de forma limitada e amostras de analitos escassos ainda podem ser analisados para múltiplas interações. Apesar de IP FCM-não requer engenharia genética, epítopo-tagging, desnaturação, ou in-vitro mistura de proteínas em um ambiente não-fisiológica, pode ser acoplado com estas e outras técnicas, tornando-se um instrumento valioso e acessível, com aplicabilidade a muitos sistemas biológicos.
Solução de problemas:
Muitos IP-FCM experimentos geram dados de interação de proteínas úteis na primeira vez que são tentados. Entretanto, a otimização da FCM-IP pode melhorar a conjugação de anticorpos para contas, captação de proteínas complexas, e sonda fluorescente vinculativo.
A eficiência de conjugação de anticorpos IP pode ser determinada pela sondagem contas acoplado diretamente com um anticorpo anti-imunoglobulina. Se essa eficiência é baixa, aumentando a concentração de anticorpos durante a reação de acoplamento podem permitir mais anticorpos IP para anexar a cada esfera. Isto pode aumentar a capacidade de ligação do lote IP talão, resultando na captura avançada e detecção de analitos. Outros primário-amina contendo moléculas (por exemplo, Tris, albumina de soro bovino) não deve estar presente durante a reação de acoplamento, uma vez que estas possam competir com o mAb para talão de fixação, resultando em acoplamento mAb baixo. Se conjugação de mAb aos grânulos prova problemático por outros motivos, ao invés contas pode ser acoplado a avidina / estreptavidina, e anticorpos biotinilados pode, posteriormente, ser não-covalente e usado para immunprecipitation.
Apesar de conjugação de anticorpos boa, a detecção inicial de talão associado fluorescência pode ser baixo. Captura, primeiro complexo em si pode ser baixa. Porque o IP-FCM depende da concentração de analitos, aumentando o número de células lisadas por volume de unidade de lise pode aumentar a captura e detecção do analito. Além disso, a captura pode ser aumentada pela diminuição do número de contas IP incubadas com o lisado, que distribui complexos capturado em contas de menos, e resulta em aumento de fluorescência média por talão quando sondada. Em segundo lugar, é possível que o acesso do anticorpo sonda para os complexos capturada é estericamente impedidas pelo anticorpo immunoprecipitating. Neste caso, o problema pode ser resolvido utilizando anticorpos diferentes para capturar e / ou sonda.
Este trabalho foi financiado pelo Prêmio Inovação Eagles (Ordem Fraternal de Eagles) e pela Fundação Mayo.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free) | Reagent | Interfacial Dynamics Corporation/Molecular Probes | 2-5000 | Store at 4°C. |
Rainbow Calibration Particles | Reagent | Spherotech, Inc. | RCP-30-5A | Store at 4°C. |
2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES) | Reagent | Sigma | M-5287 | |
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC) | Reagent | Pierce Sigma |
22980 E-6383 |
Store at -20°C under desiccating conditions. |
Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin | Reagent | Sigma | P-2714 | Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20°C. Handle with gloves. |
PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney | Reagent | Fisher | 08-408-230 | For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining |