Живая клеточного ответа на механическое раздражение Учился по комплексному Оптические и атомно-силовой микроскопии
Summary
Целью данного документа является указание читателя в работе интегрированной атомно-силовой микроскоп-оптических изображений для механической стимуляции живых клеток в культуре. Шаг за шагом протокол представлен. Набор репрезентативных данных показывает жить клеточного ответа на механическое раздражение представлена.
Abstract
Чтобы понять механизм, посредством которого живые клетки смысле механических сил, и как они реагируют и приспосабливаются к окружающей среде, новые технологии способны исследовать клетки поведения на субклеточном уровне с высоким пространственным и временным разрешением был разработан. Таким образом, атомно-силового микроскопа (АСМ) была интегрирована с полным внутренним отражением флуоресценции (TIRF) микроскопии и быстро вращающийся диск (ФУР) конфокальной микроскопии. Интегрированная система широко применяется в широком диапазоне молекулярных динамических исследований в любой сторонник живых клеток, что позволяет прямых оптических изображений клеточного ответа на механическое раздражение в режиме реального времени. Значительные перестройки актиновых филаментов и координационные спайки было показано из-за местных механических раздражений на апикальной поверхности клеток, что индуцированные изменения в клеточной структуре всей клетке тела. Эти инновационные технологии, будет предоставлять новую информацию для понимания живых клеток и реструктуризации динамика в ответ на механическую силу. Подробный протокол, а также представитель набор данных, которые показывают, жить клеточного ответа на механическое раздражение представлены.
Protocol
Discussion
7-10 цитоскелета и фокальных спайки 11-16 динамические структуры, которые собираются, разойтись и перевернуться, как клетки мигрируют или ответить на механическую силу 17. Они имеют важные функции в регуляции клеточного роста, выживания и экспрессии генов. Зная их специфи?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Винкулин-GFP плазмида подарок от Кеннета Ямада, Национальные институты здравоохранения, Национального института стоматологических и черепно-лицевых исследований, Bethesda, штат Мэриленд, и актин-mRFP плазмиду подарок от Майкла Дэвидсона, Университет штата Флорида, Таллахасси, штат Флорида.
Эта работа была поддержана NSF Карьера награду # 0747334 и AHA-Национальный SDG # 0835205N к Андреа трахеи.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| AFM tip | Novascan Technologies | 2 micron Borosilicate bead, 0.01N/m, Biotin Surface | ||
| avidin | Sigma Aldrich | A9275 | 1mg/mL in DPBS | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F4759 | 1 mg/mL | |
| DPBS | Invitrogen | 21600-051 | ||
| Amaxa transfection kit for Smooth Muscle Cells | Lonza | VPI-1004 | ||
| Mattek glass bottom dishes | MatTek Corporation | P60G-1.5-30-F | Sterile 60mm Falcon dishes with glass bottom coverslip no. 1.5 |
References
- Trache, A., Lim, S. M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. J Biomed Opt. 14, 034024-03 (2009).
- Trache, A., Meininger, G. A., Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. Atomic Force Microscopy. Current Protocols in Microbiology. , 2.1-2.17 (2008).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J Biomed Opt. 6, 6-13 (2001).
- Trache, A., Meininger, G. A., Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Current Protocols in Microbiology. , 2.1-2.22 (2008).
- Inoue, S., Inoue, T. Direct-view high-speed confocal scanner: the CSU-10. Methods Cell Biol. 70, 87-127 (2002).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. H. Atomic force microscope. Phys Rev Lett. 56, 930-933 (1986).
- Stamenović, D. Cytoskeletal mechanics in airway smooth muscle cells. Respir Physiol Neurobiol. 163, 25-32 (2008).
- Gunst, S. J., Tang, D. D., Opazo Saez, A. Cytoskeletal remodeling of the airway smooth muscle cell: a mechanism for adaptation to mechanical forces in the lung. Respir Physiol Neurobiol. 137, 151-168 (2003).
- Worth, N. F., Rolfe, B. E., Song, J., Campbell, G. R. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganization of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49, 130-145 (2001).
- Romer, H. R., Birukov, K. G., Garcia, J. G. N. Focal Adhesions: paradigm for a signaling nexus. Circulation Research. 98, 606-616 (2006).
- Opazo Saez, A., Zhang, W., Wu, Y., Turner, C. E., Tang, D. D., Gunst, S. J. Tension development during contractile stimulation of smooth muscle requires recruitment of paxillin and vinculin to the membrane. Am J Physiol Cell Physiol. 286, C433-C447 (2004).
- Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix and integrins. Sciences STKE. 119, pe6-pe6 (2002).
- Zamir, E., Geiger, B. Molecular complexity and dynamics of cell-matrix adhesions. J Cell Sci. 114, 3583-3590 (2001).
- Geiger, B., Bershdsky, A. Assembly and mechanosensory function of focal contacts. Curr Opin Cell Biol. 13, 584-592 (2001).
- Sastry, S. K., Burridge, K. Focal Adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics. Exp Cell Res. 261, 25-36 (2000).
- Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Dev Cell. 10, 11-20 (2006).
