在原位议定书“蝴蝶蛹使用Riboprobes翼
Summary
为了检验在Bicyclus anynana蛹右翼组织的基因表达，我们目前在使用riboprobes原位杂交优化协议。我们还提供指引，为进一步优化本议定书在其他鳞翅目物种蛹翅膀。
Abstract
在这里，我们目前，在视频格式，在原位杂交，在蝴蝶Bicyclus anynana的蛹翅膀使用riboprobes协议。原位杂交，发育生物学的重要支柱，是很有用的研究发展组织在转录水平的基因表达的空间和时间的模式。如果目标基因转录的蛋白产物的抗体，有尚未被开发，和/或有多个基因的拷贝无法区别使用可用抗体的基因组中的一个特定的蛋白质，在所在地可以用来代替。虽然幼虫翼光盘原位技术已经几年的蝴蝶，目前的协议进行了优化，为更大，更脆弱的蛹翅膀。
Protocol
第1天准备了以下解决方案： 10X PBS 1X PBS 1X PBT DDH 2 Ø 添加0.1％，总体积的DEPC处理和动摇的解决方案大力。 高压灭菌。 4％多聚甲醛固定 – 用PBS用DEPC 蛋白酶K的解决方案 – 如果沉淀物存在，涡大力前删除等分消化终止缓冲液预杂交缓冲 50:50 PBT：预杂交缓冲杂交缓冲液解决方案应保持无RN…
Discussion
优化现有的协议
幼虫翼片原位杂交已成功采用PRECIS coenia蝴蝶光盘（卡罗尔等人1994;。键等，1999;。Weatherbee等1999年）。从卡罗尔实验室的要求后，幼虫翼染色法进行详细的书面协议，目前协议已经适应。我们所做的改变，以适应幼虫和蛹的右翼组织之间的差异。蛹hindwing解剖期间，peripodial膜应被删除，并且不包括在井。初步修复时间更长，在我们的协议，但已被删除后的修复步骤。我们发现，10倍稀释的蛋白…
Acknowledgements
我们感谢杰恩Selegue，玛格丽特霍林斯沃思，金莓果，亮Futahashi，Najmus萨哈尔牢哈，亚历山大Popadic，鲍勃里德，罗氏帮助排除本议定书的技术支持。我们也感谢威廉彼尔编辑电影的意见。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5g/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Applied Science | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Applied Science | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma | C0612 | Mounting Medium |
References
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Citer Cet Article
Ramos, D., Monteiro, A. In situ Protocol for Butterfly Pupal Wings Using Riboprobes. J. Vis. Exp. (4), e208, doi:10.3791/208 (2007).