В месте Протокол крылья бабочки куколки Использование Riboprobes
Summary
С целью изучения экспрессии генов в ткани куколки крыло Bicyclus anynana, мы представляем оптимизированный протокол на месте гибридизации использованием riboprobes. Мы также предоставляем рекомендации по дальнейшей оптимизации этого протокола для использования в куколки крылья других видов чешуекрылых.
Abstract
Здесь мы представляем, в видео-формат, протокол на месте гибридизации в куколки крылья бабочки Bicyclus anynana использованием riboprobes. В месте гибридизации, основой биологии развития, являются полезными для изучения пространственных и временных паттернов экспрессии генов в развивающихся тканей на уровне транскрипции. Если антитела, направленные белковые продукты транскрипции генов до сих пор не разработаны, и / или Есть несколько копий гена белка в частности генома, которые не могут быть дифференцированы с использованием имеющихся антител, в места нахождения имущества может быть использован вместо. Хотя на месте техника для личинок диски крыла стала доступна для бабочки сообщества в течение нескольких лет, текущий протокол был оптимизирован для более крупных и более хрупкими куколки крылья.
Protocol
Discussion
Оптимизация существующих протоколов
В месте гибридизации на личиночной диски крыла были успешно выполнены, используя диски с Precis бабочек coenia (Carroll и др., 1994;. Ключи и др., 1999;. Уэтерби и др., 1999.). Текущий протокол был адаптирован с подробного письменного протокола по запросу из Кэрролла Лаборатор?…
Acknowledgements
Мы благодарим Джейн Selegue, Маргарет Холлингсворт, Джин Берри, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Александр Popadic, Боб Рид, Рош технической поддержки за помощью в устранении этого протокола. Мы также благодарим Уильям Piel за консультацией по редактированию фильма.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fix Buffer | 4% Paraformaldehyde in PBS | |||
| PBT | 0.1% Tween 20 in PBS | |||
| Proteinase K solution | 2.5g/ml Proteinase K in PBT | |||
| Digestion Stop Buffer | 2 mg/ml glycine in PBT | |||
| Pre-Hybridization Buffer | For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution). | |||
| Hybridization Buffer | Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer | |||
| Block Buffer | 50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Applied Science | 11 093 274 910 | Alkaline Phosphatase conjugated |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche Applied Science | 11 585 762 001 | ||
| Crystal Mount Aqueous Mounting Medium | Sigma | C0612 | Mounting Medium |
References
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52 (2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55 (2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
