Eine Kombination von drei einzigen Wellenlänge kurz gepulsten Lasern wird verwendet, um kohärente Anti-Stokes Raman-Streuung (CARS) und doppelt-Resonanz-CARS (DR-CARS) zu generieren. Die Differenz zwischen diesen Signalen bietet eine verbesserte Empfindlichkeit für sonst schwer kohärente Raman-Signale zu erkennen, so dass bildgebende der schwachen Raman Streuer.
Coherent Raman Imaging-Techniken haben einen dramatischen Anstieg der Aktivität in den letzten zehn Jahren durch ihr Versprechen, label-free optische Bildgebung mit hoher Spezifität molekularer 1 zu ermöglichen gesehen. Die Sensitivität dieser Techniken ist jedoch um viele Größenordnungen schwächer als Fluoreszenz, erfordern milli-molaren molekularen Konzentrationen 1,2. Hier beschreiben wir eine Technik, die die Detektion von schwachen oder niedrige Konzentrationen von Raman-aktiven Molekülen durch Verstärkung ihrer Signal mit, dass aus stark oder reich Raman Streuer gewonnen werden können. Das Zusammenspiel von kurzen gepulsten Lasern in einer biologischen Probe erzeugt eine Vielzahl von kohärenten Raman-Streuung Signale, von denen jede einzigartige chemische Informationen über die Probe zu tragen. In der Regel ist nur eines dieser Signale, zB kohärente Anti-Stokes Raman-Streuung (CARS), verwendet, um ein Bild zu erzeugen, während die anderen verworfen. Wenn jedoch diese anderen Signale, einschließlich 3-Farb-CARS und Vierwellenmischung (FWM), gesammelt und im Vergleich zu den CARS-Signal, da sonst schwer zu erkennen, Informationen 3 extrahiert werden. Zum Beispiel, ist doppelt-resonanten CARS (DR-CARS) das Ergebnis der konstruktiven Interferenz zwischen zwei Resonanz-Signale 4. Wir zeigen, wie Abstimmung der drei Laser benötigt, um DR-CARS-Signale, die 2845 cm -1 CH Streckschwingung in Lipiden und den 2120 cm -1 CD-Valenzschwingung einer deuterierten Moleküle (zB deuterierte Zucker, Fettsäuren, etc.) produzieren kann genutzt werden, um sowohl Raman-Resonanzen gleichzeitig Sonde werden. Unter diesen Bedingungen zusätzlich zu den CARS-Signale von jedem Resonanz, eine kombinierte DR-CARS-Signal Sondierung beide auch generiert wird. Wir zeigen, wie Erfassung der Differenz zwischen dem DR-CARS-Signal und die Verstärkung Signal von einer reichlichen Moleküls Schwingungen kann die Empfindlichkeit für das schwächere Signal zu verstärken. Wir zeigen ferner, dass dieser Ansatz erstreckt sich sogar auf Anwendungen, bei denen sowohl Signale von verschiedenen Molekülen erzeugt werden, so dass z. B. durch die starke Raman-Signal von einem Lösungsmittel kann die schwache Raman-Signal von einer verdünnten gelöste verbessern.
Raman-Spektroskopie und Raman-basierten Imaging sind mächtig aufstrebenden Werkzeuge in der Bio-Wissenschaften. Derzeit ist dies insbesondere für die in vivo und in vitro-Studie des Zellstoffwechsels und Stoffwechselstörungen in der Verarbeitung und Lagerung von Lipiden. Die meisten Bio-Makromolekülen enthalten eine große Anzahl von ähnlichen, meist Kohlenstoff basierenden molekularen Bindungen, so dass die Raman-Spektren von Zellen und Organismen gewonnen sind typischerweise eine Faltung der Beiträge aus Lipiden, Proteinen, Nukleinsäuren, Zucker, etc. sind Lipide relativ einfach Aus diesen komplexen Spektren zu isolieren, die aufgrund ihrer Neigung zu dichten Tröpfchen oder Lipid-Doppelschichten bilden, und weil sie enthalten lange Ketten mit einer großen Anzahl von aliphatischen CH-Bindungen. Unsere Fähigkeit, spezifische Proteine, Aminosäuren, RNA oder DNA innerhalb der komplexen zellulären Umgebung zu isolieren ist jedoch sehr begrenzt. Dies gilt insbesondere, wenn diese Moleküle von Interesse nur anwesend uM Konzentrationen und unten sind. Hier bietet die Möglichkeit, schwache Raman-Resonanzen Nutzung unserer neu eingeführten DR-CARS Unterschied bildgebendes Verfahren Sonde eine potentiell mächtige Ansatz für ihre chemische Mikroanalyse und Bildgebung. Zwar ist die komplizierteste Teil dieses Protokoll die Ausrichtung und die Synchronisation des Lasersystems. Beim Start aus dem Nichts, die Synchronisation der Impulse, dh der Sicherstellung, dass die Impulse in der Zeit sind trotz der unterschiedlichen Wege, die sie ergreifen können durch die Verwendung eines Impulses Autokorrelator erleichtert werden überlagert. Sobald räumliche und zeitliche Überlappung erreicht wird, CARS und DR-CARS-Signale sollten leicht nachweisbar. Allerdings ist die erste Ausrichtung oft roh, was zu schwachen Signalen. Die Best Practice für die Ausrichtung dieses System gut ist es, zunächst erzeugen schwache Signale und dann die Signalstärke, indem Sie vorsichtig die Feinabstimmung des Spiegel entlang jeder Pfad und die Anpassung der zeitlichen Überschneidung mit den Verzögerungsstufen zu verbessern. Obwohl das Spektrometer / Monochromator wirkt wie eine sehr effiziente Schallwand für Raumlicht die saubersten Ergebnisse durch den Betrieb des Systems mit der Raumbeleuchtung erreicht werden kann, ausgeschaltet und die Vorhänge oder Objektiv-Schlauch in den Hintergrund durch die verschiedenen anderen Lichtquellen (zB Computer-Monitoren eingeführt zu minimieren, Anzeige leuchtet, LEDs, etc.).
Unsere speziellen Setup nutzt Single-Photon-Counting-Lawine Fotodiode (APD)-Detektoren und zeitlich korreliert Single Photon Counting (TCSPC) Hardware für den Nachweis 5. Dies ermöglicht es uns, extrem schwache Signale mit relativ geringem Rauschen, aber viele Gruppen haben Photomultiplier-Röhren (PMT) mit variabler Verstärkung von Vorteil, wenn bei ähnlichen Messungen gefunden zu erkennen. Der Vorteil von PMT ist, dass sie mit variablem Verstärkungsfaktor bieten und haben einen viel größeren Erfassungsbereich, die Ausrichtung des Detektors vereinfachen können. Darüber hinaus nutzt unser Setup Piezo-Stufen, um das Ziel zu übersetzen, um Strahlschwenkung zu erreichen. Der Vorteil davon ist, dass wir die Fähigkeit, sich an jeder beliebigen Stelle innerhalb der zuvor gescannten Bild zurück mit einem hohen Maß an Genauigkeit und nehmen zusätzliche Messungen einschließlich spontaner Raman-Spektren haben. Andere Gruppen waren erfolgreich nutzen Scanspiegel Baugruppen oder sogar ganze konfokalen Scanning-Einheiten wie den Olympus FluoView System, das viel schneller Bildgebung bietet aber in seiner Fähigkeit, genau an beliebige Orte zurückzukehren innerhalb eines Bildes begrenzt.
Tuning der Laser passend zum Raman-Resonanz ist auch ein entscheidender Schritt, dass einige Optimierungen erfordern. Obwohl der Raman-Peaks die maximale spektrale Peak-Intensität von DR-Autos und Fahrzeuge erhalten erkennen kann, nicht unbedingt das Maximum der spontanen Raman-Peak entspricht. Dies ist auf die intrinsische Beeinflussung der Signale durch Vierwellenmischung führt zu einer nicht-resonanten Hintergrund-Signal und Autos, die CARS-Spektren relativ zur spontanen Raman-Spektren verzerrt generiert. Die spektrale Lage der Spitze des CARS-Signals berechnet werden, sondern ein praktischer Ansatz ist, die OPOs in mehreren, kleinen spektralen Schritte über die erwartete Lage der Raman-Resonanz-Melodie. Dieser Prozess sollte Ertrag ein deutliches Maximum. In der Tat, für die größte Empfindlichkeit von DR-FWM beiden Resonanzen muss zu diesem Maximum eingestellt werden.
Eine letzte mögliche Problem der DR-CARS Ansatz muss auch diskutiert werden, dh die DR-CARS-Signal wird auf eine homogene Verteilung der Raman-aktiven Verstärkung Molekül ab. Für die meisten biologischen Objekten, könnte dies auch der breiten OH-Resonanz von Wasser, das reichlich und fast allgegenwärtig ist. Wasser ist jedoch aus hydrophoben Regionen mit einer Zelle, wie Fetttröpfchen, was zu einer Verzerrung der Signale erreicht, wenn mit dem Wasser Resonanz auf Lipid-Modi verstärken ausgeschlossen. In unserem Beispiel haben wir eine Lösung von deuterierten Glukose verwendet, um eine leicht erkennbare und reichlich Signal für unsere biologischen Probe zu erzeugen. Ebenso deuteriertem Wasser oder deuterierten biologischen buffers, wie d-HEPES verwendet werden könnte. In unserem Beispiel Tröpfchen der Lipid innerhalb der C. elegans Wurms waren klein genug, um immer enthalten sowohl die deuterierte Glucose-Lösung und Lipiden innerhalb der fokussierten Laserspot unseres Systems. Dies ist jedoch in der Regel nicht wahr. Ein besonderes Beispiel würde Adipozyten, die ziemlich großen Fetttröpfchen erzeugen in ihrem Zytoplasma werden. Dies bedeutet, erfordert jedes Experiment mit dem DR-CARS-Technik durchgeführt sorgfältige Vorbereitung und Kontrolle Experimente, um die Ergebnisse zu überprüfen.
The authors have nothing to disclose.
Wir möchten Iwan Schie und Sebastian Wachsmann-Hogiu für ihre Beiträge bei der Entwicklung der DR-CARS-Technik. Tyler Wochen dankt für die Unterstützung durch die Lawrence Scholar Program von Lawrence Livermore National Laboratory. Thomas Huser ist dankbar für Unterstützung durch die American Heart Association durch die Grant-in-Aid-Programm. Diese Arbeit wurde zum Teil auch aus Mitteln der National Science Foundation unterstützt. Das Zentrum für Biophotonik, ein NSF Science and Technology Center, wird von der University of California, Davis gelungen, unter Cooperative Agreement Nr. 0120999 PHY. Unterstützung wird auch von der UCD Clinical Translational Science Center unter dem Förderkennzeichen UL1 RR024146 vom National Center for Research Resources (NCRR) anerkannt.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
60X water immersion objective | Olympus | UPLSAPO 60XW | ||
Inverted Microscope | Olympus | IX-71SIF-3 | ||
Pockels Cell | ConOptics | 350-160 | ||
Picotrain pump Laser | HighQ | IC-1064-10000 | ||
Optical Parametric Oscillator | APE | Levante IR | ||
1.5 Glass cover slips | Fisher Scientific | 12-545-102 25cm-1 | ||
Half-wave plates | Thor Labs | AHWP05M-980 | ||
Polarizing Beam Splitter Cubes | Thor Labs | PBS052 or PBS053 | ||
Spectrometer/Monochromator | PI Acton | Spectra Pro 2300i | ||
CCD Camera | PI Acton | PIXIS: 100B | ||
Avalanche Photo Diode | Perkin Elmer | SPCM-AGR-14-12691 | ||
XYZ Piezo Stage | Physik Instruments | P 733-2CL P 721.CDQ |
This is a combination of an XY stage and a Z objective holder | |
Dichroic Mirrors | Semrock | Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25 |
These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient. | |
Dichroic Mirror | Chroma | Z830rdc | To combine the different near-infrared laser beams | |
TCSPC board | PicoQuant | Timeharp 200 | ||
Symphotime Imaging Software | PicoQuant | |||
Matlab | Mathworks |