A combinação de três único comprimento de onda curto lasers pulsados é usado para gerar espalhamento anti-Stokes Raman coerente (CARS) e CARS duplamente ressonante (DR-CARS). A diferença entre estes sinais fornece maior sensibilidade para a outra forma difíceis de detectar sinais Raman coerente, permitindo que imagens de fraca dispersores Raman.
Coerente técnicas de imagem Raman ter visto um dramático aumento na atividade na última década devido à sua promessa de permitir rótulo sem imagem óptica com alta especificidade molecular 1. A sensibilidade destas técnicas, porém, é muitas ordens de grandeza mais fracas do que fluorescence, exigindo mili-molar 1,2 concentrações molecular. Aqui, descrevemos uma técnica que pode permitir a detecção de concentrações fracas ou baixas de Raman ativos moléculas, amplificando seu sinal aos obtidos com os fortes ou abundante dispersores Raman. A interação de curto lasers pulsados em uma amostra biológica gera uma variedade de sinais coerentes espalhamento Raman, cada um dos que carregam informações sobre a química única amostra. Normalmente, apenas um destes sinais, por exemplo, Coherent Anti-Stokes Raman (CARS), é usado para gerar uma imagem, enquanto os outros são descartados. No entanto, quando estes sinais, incluindo 3 cores CARS e quatro ondas de mistura (FWM), são coletados e comparados com o sinal de CARS, caso contrário, difícil de detectar informação pode ser extraída 3. Por exemplo, carros duplamente ressonante (DR-CARS) é o resultado da interferência construtiva entre dois sinais de ressonância 4. Demonstramos como ajuste dos três lasers necessários para produzir DR-CARS sinais para o 2845 centímetros vibração estiramento CH -1 em lipídios e os 2120 centímetros vibração CD -1 estiramento de uma molécula deuterada (por exemplo, açúcares deuterado, ácidos graxos, etc) pode ser utilizado para ambas as ressonâncias sonda Raman simultaneamente. Sob essas condições, além de CARS sinais de cada ressonância, um sinal DR-CARS combinado sondagem ambos também é gerado. Demonstramos como detectar a diferença entre o sinal DR-CARS e amplificando o sinal de vibração de uma molécula abundante pode ser utilizada para aumentar a sensibilidade para o sinal mais fraco. Nós ainda demonstrar que essa abordagem se estende até mesmo para aplicações onde ambos os sinais são gerados a partir de moléculas diferentes, de tal forma que por exemplo, usando o sinal forte Raman de um solvente pode melhorar o sinal fraco Raman de um soluto diluído.
A espectroscopia Raman e Raman baseado em imagens são poderosas ferramentas emergentes nas ciências bio. Atualmente, isso é particularmente verdadeiro para o in vivo e in vitro do metabolismo celular e alterações metabólicas no processamento e armazenamento de lipídios. A maioria das bio-macromoléculas contêm um grande número de semelhantes, principalmente à base de carbono ligações moleculares, de modo que os espectros Raman obtidos a partir de células e organismos são tipicamente uma convolução de contribuições de lipídios, proteínas, ácidos nucléicos, açúcares, lipídios etc são relativamente fáceis para isolar a complexidade destes espectros, devido à sua tendência a formar gotas densas ou bicamadas e porque contêm longas cadeias com um grande número de ligações CH alifáticos. Nossa capacidade de isolar proteínas específicas, aminoácidos, RNA, DNA ou dentro do ambiente complexo celular é, no entanto, muito limitada. Isto é particularmente verdadeiro se estas moléculas de interesse só estão presentes em concentrações mM e abaixo. Aqui, a habilidade de sondar fraco ressonâncias Raman utilizando a nossa recém-introduzidas DR-CARS diferença técnica de imagem fornece uma abordagem potencialmente poderosas para o seu microanálise química e de imagem. É certo que a parte mais complicada deste protocolo é o alinhamento e sincronização do sistema de laser. Quando se inicia a partir do zero, a sincronização dos pulsos, ou seja, garantir que os pulsos são sobrepostos no tempo, apesar dos caminhos diferentes que toma pode ser facilitada pela utilização de um autocorrelador pulso. Sobreposição espacial e temporal, uma vez é atingido, CARS e DR-CARS sinais deve ser facilmente detectável. No entanto, o alinhamento do primeiro muitas vezes é bruto, resultando em sinais fracos. A melhor prática para alinhar este sistema também é inicialmente gerar sinais fracos e, em seguida, para melhorar a força do sinal suavemente ajustes dos espelhos ao longo de cada caminho e ajustar a sobreposição temporal utilizando as etapas atraso. Embora os atos espectrômetro / monocromador como um defletor muito eficiente para a luz ambiente o mais limpo resultados podem ser alcançados pela operação do sistema com as luzes da sala desligado e cortinas ou tubo de lente para minimizar fundo introduzidas pelas diversas outras fontes de luz (monitores de computador, por exemplo, luzes indicadoras, LEDs, etc.)
Nossa configuração particular utiliza a contagem de fóton único avalanche foto-diodo (APD) e detectores de tempo de contagem de fótons correlacionados único (TCSPC) para detecção de hardware 5. Isso nos permite detectar sinais extremamente fracos com ruído relativamente baixo, mas muitos grupos têm encontrado foto multiplicador de tubos (PMT) com ganho variável vantajoso quando fazer medições semelhantes. A vantagem da PMT é que eles oferecem ganho variável e têm uma área de detecção muito maior que pode simplificar o alinhamento do detector. Além disso, a nossa configuração utiliza estágios piezo para traduzir o objetivo para alcançar Digitalização por feixe. A vantagem disso é que temos a capacidade de retornar para qualquer ponto dentro da imagem digitalizada anteriormente com um alto grau de precisão e tomar medidas adicionais, incluindo espectros Raman espontâneo. Outros grupos têm sido bem sucedidas montagens utilizando espelho de varredura, ou mesmo toda a unidades de varredura confocal, como o sistema FluoView Olympus, que oferece imagens muito mais rápido, mas é limitado em sua capacidade de retornar precisamente em locais arbitrários dentro de uma imagem.
Ajustando o lasers para coincidir com a ressonância Raman também é um passo crítico que pode exigir alguma otimização. Embora os picos Raman podem ser conhecidas a intensidade máxima de pico espectral obtidos a partir de DR-Carros e veículos não corresponde necessariamente ao máximo do pico Raman espontâneo. Isto é devido à interferência intrínseca de sinais gerados por quatro ondas de mistura levando a um sinal de fundo não-ressonante e CARS, o que distorce CARS espectros relativos aos espectros Raman espontâneo. A localização espectral do pico do sinal CARS pode ser calculado, mas uma abordagem mais prática é para sintonizar a OPOS em vários pequenos passos espectrais em todo o local esperado da ressonância Raman. Este processo deve render um máximo claro. De fato, para a maior sensibilidade da DR-FWM tanto ressonâncias deve ser ajustado para esse valor máximo.
Um último problema potencial da abordagem DR-CARS tem que ser discutido, ou seja, o sinal DR-CARS vai depender de uma distribuição homogênea da molécula Raman ativos ampliando. Para a maioria dos objetos biológicos, isso poderia muito bem ser a ressonância OH ampla da água, que é abundante e quase onipresente. A água é, no entanto, excluídos regiões hidrofóbicas com uma célula, como gotículas lipídicas, levando uma distorção dos sinais obtidos quando se utiliza a ressonância de água para amplificar os modos de lipídios. No nosso exemplo, usamos uma solução de glicose deuterado para gerar um sinal facilmente detectável e abundante para a nossa amostra biológica. Da mesma forma, deuterado água ou deuterado Buffe biológicars, tais como d-HEPES poderia ser usado. No nosso exemplo, o gotículas lipídicas dentro do C. elegans foram suficientemente pequeno para sempre contêm tanto, a solução de glicose e lipídios deuterado dentro do local de laser focalizado do nosso sistema. Isso, no entanto, geralmente não é verdade. Um exemplo particular seria adipócitos, que geram gotículas lipídicas dentro de seu bastante grande citoplasma. Isso significa que, qualquer experimento realizado com a técnica DR-CARS exige uma preparação cuidadosa e experimentos de controle para verificar os resultados.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer Iwan Schie e Sebastian Wachsmann-Hogiu por suas contribuições no desenvolvimento da técnica de DR-CARS. Semanas Tyler reconhece o apoio do Programa Acadêmico de Lawrence Lawrence Livermore National Laboratory. Thomas Huser é grato pelo apoio da Associação Americana do Coração, através do programa Bolsa-in-Aid. Este trabalho também foi apoiado em parte graças ao financiamento da National Science Foundation. O Centro de Biophotonics, um NSF Ciência e Tecnologia Center, é gerido pela Universidade da Califórnia, em Davis, nos termos do Acordo de Cooperação n º 0120999 PHY. O suporte também é reconhecido a partir do Centro de Ciências Clínicas UCD translacional em conceder número UL1 RR024146 do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos (NCRR).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
60X water immersion objective | Olympus | UPLSAPO 60XW | ||
Inverted Microscope | Olympus | IX-71SIF-3 | ||
Pockels Cell | ConOptics | 350-160 | ||
Picotrain pump Laser | HighQ | IC-1064-10000 | ||
Optical Parametric Oscillator | APE | Levante IR | ||
1.5 Glass cover slips | Fisher Scientific | 12-545-102 25cm-1 | ||
Half-wave plates | Thor Labs | AHWP05M-980 | ||
Polarizing Beam Splitter Cubes | Thor Labs | PBS052 or PBS053 | ||
Spectrometer/Monochromator | PI Acton | Spectra Pro 2300i | ||
CCD Camera | PI Acton | PIXIS: 100B | ||
Avalanche Photo Diode | Perkin Elmer | SPCM-AGR-14-12691 | ||
XYZ Piezo Stage | Physik Instruments | P 733-2CL P 721.CDQ |
This is a combination of an XY stage and a Z objective holder | |
Dichroic Mirrors | Semrock | Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25 |
These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient. | |
Dichroic Mirror | Chroma | Z830rdc | To combine the different near-infrared laser beams | |
TCSPC board | PicoQuant | Timeharp 200 | ||
Symphotime Imaging Software | PicoQuant | |||
Matlab | Mathworks |