Sıçan Siyatik Sinir Axoplasm İzolasyon
Summary
Biz yetişkin sıçan siyatik sinir miyelin bırakın ve kalan akson zenginleştirilmiş malzeme çıkarılması takip olmayan aksonal yapıları, lyse hipotonik orta sinir fasiküller ve kuluçka diseksiyonu dayalı axoplasm izolasyonu için bir protokol göstermektedir.
Abstract
Periferik sinir saf aksonal sitoplazma (axoplasm) izolasyonu birçok biyolojik süreçlerin biyokimyasal çalışmalar için çok önemlidir. Bu makalede, biz göstermek ve yetişkin sıçan siyatik sinir aşağıdaki adımları dayalı axoplasm izolasyonu için bir protokol tarif: (1) sinir fasiküller ve bağ dokusu ayrılması diseksiyon, hipotonik ortamda sinir fasiküller kısa kesimleri (2) inkübasyon miyelin olmayan aksonal yapılar bırakın ve lyse; ve (3) kalan akson zenginleştirilmiş malzeme çıkarma. Bu hazırlık Proteomik ve biyokimyasal karakterizasyonu aksonal bileşenleri zenginleştirmek için yüksek derecede onaylamıştır.
Protocol
Discussion
Biyokimyasal ve proteomik analiz, mekanik sıkmak 1 axoplasm izolasyonu için daha önce açıklanan yöntemleri ile karşılaştırıldığında bu yordamı serum ve glial hücre kontaminasyonu 3 azalttığını teyit etmiştir . Biz, sonra dynein tabanlı retrograd sinyalizasyon siyatik sinir yaralanması 2 keşfetmek ve erişkin periferik sinir akson-glia etkileşimler de dahil olmak üzere 4 arama, pek çok diğer işlemler yardımcı olmasını bekliyoruz bu axoplasm izol…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
- Male Wistar rats (8-10 weeks old)
- PBS 0.2X and PBS 1X solutions containing protease inhibitors (Roshe) 2 tablets per 50 ml
- Eppendorfs for 1.5 ml
- Sterilized plastic dishes 35 mm
- Dissecting tools including: scissors and fine forceps
- Binocular and table light
Antibodies
Mouse anti-GFAP clone G-A-5 was from Sigma (G6171). Rabbit anti-Albumin was from Cedarlane (CLAG5140). Mouse anti-Tubulin β3 and rabbit anti-gERK were from Sigma (T2200 and M5670 respectively).
References
- Hanz, S., Perlson, E., Willis, D., Zheng, J. Q., Massarwa, R., Huerta, J. J., Koltzenburg, M., Kohler, M., van-Minnen, J., Twiss, J. L. Axoplasmic importins enable retrograde injury signaling in lesioned nerve. Neuron. 40, 1095-1104 (2003).
- Michaelevski, I., Medzihradszky, K. F., Lynn, A., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. Axonal transport proteomics reveals mobilization of translation machinery to the lesion site in injured sciatic nerve. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 976-987 (2010).
- Rishal, I., Michaelevski, I., Rozenbaum, M., Shinder, V., Medzihradszky, K. F., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. Axoplasm isolation from peripheral nerve. Dev Neurobiol. 70, 126-133 (2010).
- Twiss, J. L., Fainzilber, M. Ribosomes in axons–scrounging from the neighbors. Trends Cell Biol. 19, 236-243 (2009).
