Studiare gli effetti di rigidità Matrix sulla funzione cellulare utilizzando acrilamide a base di idrogeli
Summary
L'effetto di rigidità substrati sulla funzione cellulare può essere modellato<em> In vitro</em> Utilizzando idrogel di poliacrilamide di varia conformità.
Abstract
Rigidità del tessuto è un importante determinante della funzione cellulare, e cambiamenti nella rigidità dei tessuti sono comunemente associati con fibrosi, cancro e malattie cardiovascolari 1-11. Approcci tradizionali cellule biologiche per studiare la funzione cellulare coinvolgono le cellule coltura su un substrato rigido (piatti di plastica o vetro coprioggetto) che non possono spiegare l'effetto di un ECM elastico o le variazioni di rigidezza ECM tra i tessuti. Per modellare condizioni in vivo nel rispetto dei tessuti in vitro, noi e altri usano ECM rivestite idrogel. Nel nostro laboratorio, l'idrogel si basano su poliacrilammide che possono mimare la gamma di conformità dei tessuti biologicamente visto 12. "Reattiva" coprioggetto sono generati da incubazione con NaOH seguita da aggiunta di 3-APTMS. Glutaraldeide è usato per cross-link del 3-APTMS e il gel di poliacrilammide. Una soluzione di acrilamide (AC), bis-acrilamide (Bis-AC) e persolfato di ammonio è usato per la polimerizzazione degli idrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) è incorporato nella soluzione CA per proteine crosslink ECM per l'idrogel. A seguito di polimerizzazione del idrogel, la superficie del gel è rivestita con una proteina ECM di scelta, come fibronectina, vitronectina, collagene, ecc
La rigidità di un idrogel può essere determinato da reologia o microscopia a forza atomica (AFM) e regolata variando la percentuale di AC e / o bis-CA nella soluzione di 12. In questo modo, la rigidità substrato può essere abbinata alla rigidità dei tessuti biologici che può anche essere quantificato mediante reologia o AFM. Le celle possono poi essere seminato in questi idrogel e colti sulla base delle condizioni sperimentali richieste. Imaging delle cellule e il loro recupero per l'analisi molecolare è semplice. Per questo articolo, si definisce substrati morbidi come quelli che hanno moduli elastici (E) <3000 Pascal e substrati rigidi / tessuti come quelli con E> 20.000 Pascal.
Protocol
Discussion
Un elemento cruciale del processo di polimerizzazione idrogel è quello di evitare la formazione di bolle d'aria che consentono alle cellule di legarsi al coprioggetto di vetro piuttosto che l'ECM rivestite stesso idrogel. Ciò può essere evitato con cura di pipettaggio la soluzione di polimerizzazione dopo vortex e visivamente fare in modo che bolle d'aria sono intrappolati nel gel. Noi consigliamo sempre la preparazione aggiuntiva "a caldo" coprioggetto e idrogeli per assicurare avere abbastanza…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è il nostro laboratorio è supportato anche da finanziamenti del National Institutes of Health.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Glutaraldehyde, 70% | Sigma-Aldrich | G7776 | Store at -20°C | |
| 3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilane 97%) | Sigma-Aldrich | 281778 | Store at room temperature | |
| SurfaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific | 42800 | Store at room temperature | |
| NHS (N-hydroxysucinimide Ester) | Sigma-Aldrich | A-8060 | Store at 4°C Replace monthly | |
| Albumin, bovine serum, essentially fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003-100G | Store at 4°C | |
| Coverslips (25mm) | Fisher Scientific | 12-545-86 25 Cir 1D | ||
| Coverslips (18mm) | Fisher Scientific | 12-545-84 18 Cir 1D |
References
- Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta. J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).
- Bernini, G. Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibrosis in patients with primary aldosteronism. J Hypertens. 26, 2399-2405 (2008).
- Boonyasirinant, T. Aortic stiffness is increased in hypertrophic cardiomyopathy with myocardial fibrosis: novel insights in vascular function from magnetic resonance imaging. J Am Coll Cardiol. 54, 255-2562 (2009).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Duprez, D. A., Cohn, J. N. Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).
- Lee, R. T. Prediction of mechanical properties of human atherosclerotic tissue by high-frequency intravascular ultrasound imaging. An in vitro study. Arterioscler Thromb. 12, 1-5 (1992).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples. Phys Med Biol. 52, 1565-1576 (2007).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad Sci USA. 94, 13661-13665 (1997).
- Klein, E. A., Yung, Y., Castagnino, P., Kothapalli, D., Assoian, R. K. Cell adhesion, cellular tension, and cell cycle control. Methods Enzymol. 426, 155-175 (2007).
- Klein, E. A. Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening. Current Biology. 19, 1511-1518 (2009).
