دراسة آثار تصلب مصفوفة على وظيفة الخلوية باستخدام الأكريلاميد المستندة الهلاميات المائية
Summary
يمكن أن تكون على غرار تأثير على وظيفة صلابة الطبقات التحتية الخلوية<em> في المختبر</em> استخدام الهلاميات المائية بولي أكريلاميد متفاوتة التوافق.
Abstract
تصلب الأنسجة عاملا هاما في تحديد وظيفة الخلوية ، وترتبط عادة التغيرات في تصلب الأنسجة مع السرطان ، والتليف الرئوي وأمراض القلب والشرايين 11/01. نهج الخلية البيولوجية التقليدية لدراسة وظيفة الخلوية تنطوي على زراعة الخلايا التحتية الصلبة (الأطباق البلاستيك أو الزجاج coverslips) والتي لا يمكن حساب لتأثير وجود مرونة ECM أو الاختلافات في تصلب الأنسجة بين ECM. لنموذج في الجسم الحي شروط الامتثال الأنسجة في المختبر ، ونحن وآخرون استخدام ECM المغلفة الهلاميات المائية. في مختبرنا ، تستند على بولي أكريلاميد الهلاميات المائية التي يمكن أن تحاكي مجموعة من التوافق الأنسجة البيولوجية المشاهدة 12. يتم إنشاء "رد الفعل" زلات تغطية الحضانة مع هيدروكسيد الصوديوم التي تليها إضافة APTMS – 3. يستخدم غلوتارالدهيد العابرة للربط 3 APTMS وهلام بولي أكريلاميد. يستخدم محلول من مادة الأكريلاميد (ميلان) ، مكررا الأكريلاميد (BIS – AC) وبيرسلفات الأمونيوم للبلمرة من هيدروجيل. أدرج N – hydroxysuccinimide (NHS) في حل التيار المتردد لبروتين ECM تشعبي إلى هيدروجيل. بعد البلمرة لهيدروجيل ، وهي مغلفة سطح هلام مع البروتين ECM اختيار مثل فبرونيكتين الكولاجين ، vitronectin ، الخ.
ويمكن تحديد صلابة من هيدروجيل الريولوجيا أو بواسطة المجهر القوة الذرية (AFM) وتعديلها من خلال تغيير نسبة AC و / أو مكررا AC – 12 في الحل. بهذه الطريقة ، يمكن أن تكون مطابقة صلابة التحتية للتصلب الأنسجة البيولوجية التي يمكن أيضا أن يكون كميا أو باستخدام الريولوجيا فؤاد. ويمكن عندئذ أن تكون خلايا المصنف على هذه الهلاميات المائية وتربيتها على أساس الظروف التجريبية المطلوبة. تصوير الخلايا وشفائهم للتحليل الجزيئي واضح ومباشر. لهذه المقالة ، أن نحدد الطبقات التحتية لينة ومرنة وجود تلك moduli (E) <3000 باسكال والطبقات التحتية تيبس / مثل تلك الأنسجة مع E> 20000 باسكال.
Protocol
Discussion
وثمة عنصر حاسم في عملية البلمرة هيدروجيل لتجنب تشكيل فقاعة الهواء التي تسمح الخلايا لربط ساترة الزجاج بدلا من هيدروجيل ECM المغلفة نفسها. ويمكن منع ذلك عن طريق حل pipetting بعناية بعد البلمرة vortexing البصر ، وجعل على يقين من أي فقاعات هواء أصبحت المحاصرين في هلام. كنا دائما ن?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
العمل هو معتمد مختبرنا من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Glutaraldehyde, 70% | Sigma-Aldrich | G7776 | Store at -20°C | |
| 3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilane 97%) | Sigma-Aldrich | 281778 | Store at room temperature | |
| SurfaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific | 42800 | Store at room temperature | |
| NHS (N-hydroxysucinimide Ester) | Sigma-Aldrich | A-8060 | Store at 4°C Replace monthly | |
| Albumin, bovine serum, essentially fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003-100G | Store at 4°C | |
| Coverslips (25mm) | Fisher Scientific | 12-545-86 25 Cir 1D | ||
| Coverslips (18mm) | Fisher Scientific | 12-545-84 18 Cir 1D |
References
- Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta. J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).
- Bernini, G. Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibrosis in patients with primary aldosteronism. J Hypertens. 26, 2399-2405 (2008).
- Boonyasirinant, T. Aortic stiffness is increased in hypertrophic cardiomyopathy with myocardial fibrosis: novel insights in vascular function from magnetic resonance imaging. J Am Coll Cardiol. 54, 255-2562 (2009).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Duprez, D. A., Cohn, J. N. Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).
- Lee, R. T. Prediction of mechanical properties of human atherosclerotic tissue by high-frequency intravascular ultrasound imaging. An in vitro study. Arterioscler Thromb. 12, 1-5 (1992).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples. Phys Med Biol. 52, 1565-1576 (2007).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad Sci USA. 94, 13661-13665 (1997).
- Klein, E. A., Yung, Y., Castagnino, P., Kothapalli, D., Assoian, R. K. Cell adhesion, cellular tension, and cell cycle control. Methods Enzymol. 426, 155-175 (2007).
- Klein, E. A. Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening. Current Biology. 19, 1511-1518 (2009).
