Studera effekter av Matrix Stelhet på cellulär funktion med Akrylamid-baserade Hydrogeler
Summary
Effekten av substrat stelhet på cellulär funktion kan modelleras<em> In vitro</em> Hjälp polyakrylamid hydrogeler av varierande efterlevnad.
Abstract
Tissue styvhet är en viktig faktor för cellulär funktion, och förändringar i vävnaden styvhet är vanligen associerat med fibros, cancer och hjärt-kärlsjukdom 1-11. Traditionella cellbiologiska metoder för att studera cellfunktioner innebär odling celler på ett styvt underlag (plastskålar eller täckglas glas) som inte kan kompensera för inverkan av en elastisk ECM eller variationer i ECM styvhet mellan vävnader. Att modellera in vivo-förhållanden vävnad efterlevnad in vitro, vi och andra använder ECM-belagda hydrogel. I vårt laboratorium, är hydrogeler baseras på polyakrylamid som kan härma olika vävnader efterlevnad sett biologiskt 12. "Reaktiv" täckglas genereras genom inkubering med NaOH följt av tillägg av 3-APTMS. Glutaraldehyd används för att länka till 3-APTMS och polyakrylamidgel. En lösning av akrylamid (AC), bis-akrylamid (Bis-AC) och ammonium persulfate används för polymerisation av hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) har införlivats med AC lösningen Crosslink ECM protein till hydrogel. Efter polymerisation av hydrogel är gelen ytan belagd med en ECM protein val som fibronektin, vitronektin, kollagen, etc.
Styvheten i en hydrogel kan fastställas genom reologi eller atomkraftsmikroskopi (AFM) och justeras genom att variera andelen AC och / eller bis-AC i lösningen 12. På detta sätt kan underlaget stelhet anpassas till styvheten i biologisk vävnad som också kan kvantifieras med hjälp av reologi och AFM. Celler kan sedan seedade på dessa hydrogeler och odlade baserat på krävs experimentella förhållanden. Avbildning av celler och deras återhämtning för molekylär analys är enkel. För den här artikeln definierar vi mjuka substrat som de som har elastiska böjmotståndet (E) <3000 Pascal och styva substrat / vävnader som de med E> 20.000 Pascal.
Protocol
Discussion
En avgörande del av hydrogel polymerisation processen är att undvika att luft bubblor bildas som gör att cellerna binder till glaset täckglas stället för ECM-belagda hydrogel själv. Detta kan förhindras genom att försiktigt pipettera den polymerisation lösning efter vortexa och visuellt se till att inga luftbubblor har blivit fångade i gelen. Vi rekommenderar alltid att förbereda ytterligare "reaktiv" täckglas och hydrogeler att se till att ha tillräckligt för experiment.
<p class="jove_cont…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbete är vårt laboratorium stöds med bidrag från National Institutes of Health.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Glutaraldehyde, 70% | Sigma-Aldrich | G7776 | Store at -20°C | |
| 3-APTMS (3-Aminopropyltrimethosysilane 97%) | Sigma-Aldrich | 281778 | Store at room temperature | |
| SurfaSil Siliconizing Fluid | Thermo Scientific | 42800 | Store at room temperature | |
| NHS (N-hydroxysucinimide Ester) | Sigma-Aldrich | A-8060 | Store at 4°C Replace monthly | |
| Albumin, bovine serum, essentially fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003-100G | Store at 4°C | |
| Coverslips (25mm) | Fisher Scientific | 12-545-86 25 Cir 1D | ||
| Coverslips (18mm) | Fisher Scientific | 12-545-84 18 Cir 1D |
References
- Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta. J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).
- Bernini, G. Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibrosis in patients with primary aldosteronism. J Hypertens. 26, 2399-2405 (2008).
- Boonyasirinant, T. Aortic stiffness is increased in hypertrophic cardiomyopathy with myocardial fibrosis: novel insights in vascular function from magnetic resonance imaging. J Am Coll Cardiol. 54, 255-2562 (2009).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Duprez, D. A., Cohn, J. N. Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).
- Lee, R. T. Prediction of mechanical properties of human atherosclerotic tissue by high-frequency intravascular ultrasound imaging. An in vitro study. Arterioscler Thromb. 12, 1-5 (1992).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples. Phys Med Biol. 52, 1565-1576 (2007).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc. Natl. Acad Sci USA. 94, 13661-13665 (1997).
- Klein, E. A., Yung, Y., Castagnino, P., Kothapalli, D., Assoian, R. K. Cell adhesion, cellular tension, and cell cycle control. Methods Enzymol. 426, 155-175 (2007).
- Klein, E. A. Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening. Current Biology. 19, 1511-1518 (2009).
