Geração de transgênicos C. elegans Por biobalística Transformação
Summary
Worms transgênicos são comumente usados em<em> C. elegans</em> Pesquisa. Descrito é um protocolo simples, mas eficaz, para introduzir transgenes em vermes usando biobalística bombardeio com partículas de DNA revestido de ouro. O esforço envolvido e os resultados do bombardeio comparam favoravelmente com microinjeção para a geração de animais transgênicos.
Abstract
O número de laboratórios usando o C. nematóide de vida livre elegans está crescendo rapidamente. A popularidade deste modelo biológico é atribuído a um tempo de geração rápido e vida curta, manutenção fácil e barata, o genoma completamente seqüenciado, e matriz de RNAi recursos e animais mutantes. Além disso, a análise do C. elegans genoma revelou uma grande semelhança entre worms e vertebrados superiores, o que sugere que a pesquisa em vermes pode ser um complemento importante para os estudos realizados em ratos inteiros ou células em cultura. Uma parte poderosa e importante de pesquisa worm é a capacidade de usar animais transgênicos para estudar a localização ea função do gene. Animais transgênicos podem ser criadas através de microinjeção da linha germinativa worm ou através do uso de bombardeio biobalística. Bombardeio é uma nova técnica e é menos familiar para uma série de laboratórios. Aqui nós descrevemos um protocolo simples para gerar worms transgênicas por biobalística bombardeio com partículas de ouro usando o Bio-Rad PDS-1000 do sistema. Em comparação com a microinjeção de DNA em células germinativas hermafroditas, este protocolo tem a vantagem de não exigir habilidades especiais do operador com relação à identificação de anatomia worm ou realizar microinjeção. Além disso várias linhagens transgênicas são normalmente obtidos a partir de um único bombardeio. Também em contraste com a microinjeção, bombardeio biobalística produz animais transgênicos com ambos os arrays e extracromossómicos transgenes integrados. A capacidade de obter linhagens transgênicas integrada pode evitar o uso de protocolos mutagênico para integrar DNA estranho. Em conclusão, o bombardeio biobalística pode ser um método atrativo para a geração de animais transgênicos, especialmente para os pesquisadores não estão interessados em investir o tempo eo esforço necessário para se tornar hábil em microinjeção.
Protocol
Discussion
Bombardeio biobalística é um método simples para introduzir DNA estranho para muitos organismos, incluindo C. elegans 1,5,6,7,16. Ele se baseia partículas de ouro formando um complexo com o DNA na presença de CaCl 2. Poliaminas catiônicas, tais como a espermidina, proteger o DNA de nuclease degradação in vivo. Desde espermidina é uma molécula instável, é importante para armazená-lo em pequenas alíquotas a -20 ° C, e fazer a solução certa antes de realizar o bombardeio. Com…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por fundos de sementes da Universidade de Pittsburgh e conceder NIH AG028977 para ALF
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Gold particles | Inbio gold | BD021 | 1micron | |
| Midiprep kit | Qiagen | 12143 | ||
| Spermidine | Sigma | S4139 | ||
| Protamine | Sigma | P4505 | ||
| Macrocarriers | Biorad | 165-2335 | ||
| PDS-1000/He Hepta System | Biorad | 165-2257 | ||
| Rupture disk | Biorad | 165-2330 | ||
| Nystatin | Sigma | N1638 | ||
| Streptomycin | MP | 100556 |
References
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