Des vers transgéniques sont couramment utilisés dans C. elegans Recherche. Décrite est un protocole simple, mais efficace, d'introduire des transgènes dans les vers utilisant bombardement biolistique avec des particules d'or enrobées d'ADN. L'effort et les résultats des bombardements se comparent favorablement avec microinjection pour la génération d'animaux transgéniques.
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Article de méthode
Génération de souris transgéniques C. elegans Par transformation biolistique
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Résumé
Résumé
Le nombre de laboratoires utilisant le C nématodes vivant libre elegans est en croissance rapide. La popularité de ce modèle biologique est attribué à un temps de génération rapide et courte durée de vie, entretien facile et peu coûteux, génome entièrement séquencé, et le tableau des ressources et des animaux mutants ARNi. De plus, l'analyse de la C. elegans du génome a révélé une grande similitude entre les vers et les vertébrés supérieurs, ce qui suggère que la recherche dans les vers pourrait être un complément important aux études effectuées chez la souris tout ou cellules cultivées. Une partie puissant et important de la recherche ver est la possibilité d'utiliser des animaux transgéniques pour étudier la localisation des gènes et leur fonction. Les animaux transgéniques peuvent être créées soit par micro-injection de la lignée germinale ver ou par l'utilisation de bombardement biolistique. Bombardement est une technique plus récente et est moins familier à un certain nombre de laboratoires. Nous décrivons ici un protocole simple de générer des vers transgéniques par bombardement biolistique avec des particules d'or en utilisant le Bio-Rad PDS-1000 du système. Par rapport à la microinjection d'ADN dans les cellules germinales hermaphrodites, ce protocole a l'avantage de ne pas nécessiter de compétences particulières de l'opérateur en ce qui concerne l'identification d'anatomie ver ou d'effectuer la microinjection. En outre plusieurs lignées transgéniques sont généralement obtenus à partir d'un bombardement unique. Aussi, contrairement à la micro-injection, bombardement biolistique produit des animaux transgéniques avec les deux tableaux extrachromosomique et des transgènes intégrés. La capacité d'obtenir des lignées transgéniques intégrés permet d'éviter l'utilisation de protocoles mutagène d'intégrer l'ADN étranger. En conclusion, le bombardement biolistique peut être une méthode intéressante pour la production d'animaux transgéniques, en particulier pour les enquêteurs ne s'intéressent pas à investir le temps et les efforts nécessaires pour devenir habile à la microinjection.
Protocole
Aperçu
Traditionnellement les vers transgéniques ont été générées par micro-injection d'ADN transgénique dans le C. elegans germinale 1,2,3,4. Bien réussie, cette approche nécessitait des équipements spécialisés et le développement de l'expérience avec l'anatomie ver et la technique de micro-injection. Plus récemment bombardement biolistique a été développé comme une autre approche qui utilise des particules d'or enrobées d'ADN pour introduire un ADN étranger dans le 5,6 germinale. Cette approche exige un investissement de moins de temps en termes de pratique pour réussir.
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Discussion
Bombardement biolistique est une méthode simple pour introduire un ADN étranger dans de nombreux organismes, y compris C. elegans 1,5,6,7,16. Elle repose sur des particules d'or formant un complexe avec l'ADN en présence de CaCl 2. Polyamines cationiques, tels que la spermidine, de protéger l'ADN de la dégradation de la nucléase in vivo. Depuis la spermidine est une molécule instable, il est important de le stocker dans de petites aliquotes à -20 ° C, et de faire la bonne solut.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des fonds d'amorçage de l'Université de Pittsburgh et aux NIH AG028977 ALF
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Particules d'or | Inbio gold | BD021 | 1micron |
| Kits de midi-préparation | Qiagen | 12143 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S4139 | |
| Protamine | Sigma-Aldrich | P4505 | |
| Macroporteurs | Bio-Rad | 165-2335 | |
| Système PDS-1000/He Hepta | Bio-Rad | 165-2257 | |
| Disque de rupture | Bio-Rad | 165-2330 | |
| Nystatine | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Streptomycine | MP Biomedicals | 100556 |
Références
- Evans, T. C. Wormbook. , 1-15 (2006).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA tr....
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Réimpressions et autorisations
Erratum
Formal Correction: Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation
Posted by JoVE Editors on 12/12/2012. Citeable Link.
The volume for a solution in, Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation, was incorrect.
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