Generación de transgénicos C. elegans Por la transformación biolística
Summary
Gusanos transgénicos se utilizan comúnmente en<em> C. elegans</em> La investigación. Descrito es un protocolo simple, pero eficaz, para introducir transgenes en los gusanos usando bombardeo biolística con partículas de oro recubiertas de ADN. El esfuerzo que implica y los resultados de los bombardeos se comparan favorablemente con microinyección para la generación de animales transgénicos.
Abstract
El número de laboratorios que utilizan el nematodo C. vida libre elegans está creciendo rápidamente. La popularidad de este modelo biológico se atribuye a un tiempo de generación rápida y corta vida, fácil mantenimiento y bajo costo, el genoma secuenciado en su totalidad, y la variedad de recursos de ARN de interferencia y los animales mutantes. Además, el análisis de la C. elegans genoma revela una gran similitud entre los gusanos y los vertebrados superiores, lo que sugiere que la investigación en los gusanos podrían ser un complemento importante a los estudios realizados en ratones enteros o células cultivadas. Una parte muy importante de la investigación y el gusano es la capacidad de utilizar animales transgénicos para estudiar la localización de genes y su función. Los animales transgénicos pueden ser creadas a través de la microinyección de la línea germinal o gusano a través del uso de bombardeos biolística. El bombardeo es una técnica más reciente y menos conocida de una serie de laboratorios. A continuación se describe un protocolo sencillo para generar gusanos transgénicos por el bombardeo con partículas de oro biolística con el Bio-Rad PDS-1000 del sistema. En comparación con microinyección de ADN en la línea germinal hermafrodita, este protocolo tiene la ventaja de no requerir habilidades especiales de los operadores en lo que respecta a la identificación de la anatomía del gusano o la realización de la microinyección. Además varias líneas transgénicas se obtienen generalmente a partir de un bombardeo sola. También a diferencia de la microinyección, el bombardeo biolística produce animales transgénicos con ambas matrices extracromosómico y transgenes integrados. La capacidad de obtener integrada líneas transgénicas puede evitar el uso de protocolos mutagénico para integrar ADN ajeno. En conclusión, el bombardeo biolística puede ser un método atractivo para la generación de animales transgénicos, en especial para los investigadores no están interesados en invertir tiempo y esfuerzo necesario para aprender a microinyección.
Protocol
Discussion
Biolística bombardeo es un método sencillo para introducir ADN extraño en muchos organismos, incluyendo C. elegans 1,5,6,7,16. Se basa en las partículas de oro formando un complejo con el ADN en presencia de CaCl2. Poliaminas catiónicas, tales como la espermidina, proteger el ADN de la degradación de la nucleasa en vivo. Dado que la espermidina es una molécula inestable, es importante guardarla en pequeñas alícuotas a -20 ° C, y que la solución adecuada antes de realizar el bomb…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por fondos de la semilla de la Universidad de Pittsburgh y los NIH AG028977 a ALF
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Gold particles | Inbio gold | BD021 | 1micron | |
| Midiprep kit | Qiagen | 12143 | ||
| Spermidine | Sigma | S4139 | ||
| Protamine | Sigma | P4505 | ||
| Macrocarriers | Biorad | 165-2335 | ||
| PDS-1000/He Hepta System | Biorad | 165-2257 | ||
| Rupture disk | Biorad | 165-2330 | ||
| Nystatin | Sigma | N1638 | ||
| Streptomycin | MP | 100556 |
References
- Evans, T. C. . Wormbook. , 1-15 (2006).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Génétique. 157, 1217-1226 (2001).
- Wilm, T., Demel, P., Koop, H. U., Schnabel, H., Schnabel, R. Ballistic transformation of Caenorhabditis elegans. Gene. 229, 31-35 (1999).
- Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic Acids Res. 32, e40-e40 (2004).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Génétique. 141, 977-988 (1995).
- Riddle, D. L., Swanson, M. M., Albert, P. S. Interacting genes in nematode dauer larva formation. Nature. 290, 668-671 (1981).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Conservation of function and expression of unc-119 from two Caenorhabditis species despite divergence of non-coding DNA. Gene. 183, 77-85 (1996).
- Ferguson, A. A., Fisher, A. L. Retrofitting ampicillin resistant vectors by recombination for use in generating C. elegans transgenic animals by bombardment. Plasmid. 62, 140-145 (2009).
- Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering. BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-30 (1995).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R., Wood, W. B. . The nematode, Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).
- Sivamani, E., DeLong, R. K., Qu, R. Protamine-mediated DNA coating remarkably improves bombardment transformation efficiency in plant cells. Plant Cell Rep. 28, 213-221 (2009).
- Johnston, S. A. Biolistic transformation: microbes to mice. Nature. 346, 776-777 (1990).
