Un test pour mesurer l'activité des Escherichia coli Inductible Lysine Decarboxyase
Summary
L'activité de la décarboxylase inductible lysine est contrôlée par la réaction du substrat L-lysine et la cadavérine produit avec l'acide 2,4,6-trinitrobenzensulfonic pour former des adduits qui ont une solubilité différentielle dans le toluène.
Abstract
Escherichia coli est une bactérie entérique qui est capable de croître sur un large éventail de valeurs de pH (pH 5 – 9) 1 et, incroyablement, est capable de survivre à l'acide extrêmes souligne notamment le passage par l'estomac des mammifères où le pH peut descendre jusqu'à comme un pH de 1 – 2 2. Pour permettre un tel éventail de survie pH acide, E. coli possède quatre différents décarboxylases inductible acide aminé qui décarboxyler leurs acides aminés dans un substrat de manière à protons dépend donc élever le pH interne. Le décarboxylases inclure le glutamique décarboxylases Gada et BDAG 3, le arginine décarboxylase Adia 4, la lysine décarboxylase LdcI 5, 6 et l'ornithine décarboxylase SPEF 7. Toutes ces enzymes utilisent le pyridoxal-5'-phosphate comme un co-facteur 8 et fonctionnent ensemble avec intérieur de la membrane du substrat sous-produits qui éliminent les produits antiporteurs décarboxylation au milieu extérieur, en échange de substrat frais 2. Dans le cas de LdcI, le antiporteur lysine cadavérine est appelé CADB. Récemment, nous avons déterminé la structure cristalline aux rayons X des LdcI à 2,0 Å, et nous avons découvert un petit roman-molécule liée à la guanosine LdcI réponse strictes régulateur de 5'-diphosphate, 3'-diphosphate (ppGpp) 14. La réponse sévères survient lorsque des cellules en croissance exponentielle expérience de privation des éléments nutritifs ou l'un des nombreux autres types de stress 9. En conséquence, les cellules produisent ppGpp qui conduit à une cascade de signalisation aboutissant à l'évolution de la croissance exponentielle de la croissance en phase stationnaire 10. Nous avons démontré que ppGpp est un inhibiteur spécifique de LdcI 14. Nous décrivons ici le dosage lysine décarboxylase, modifié par le dosage développée par Phan et al. 11, que nous avons utilisée pour déterminer l'activité de LdcI et l'effet de pppGpp / ppGpp sur cette activité. La réaction de décarboxylation LdcI supprime le groupe α-carboxy de la L-lysine et produit du dioxyde de carbone et la cadavérine polyamine (1,5-diaminopentane) 5. L-lysine et la cadavérine peuvent réagir avec l'acide 2,4,6-trinitrobenzensulfonic (TNBS) à pH élevé pour générer N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadavérine) et N, N'-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectivement 11. Le TNP-cadavérine peuvent être séparés du TNP-lysine que l'ancien est soluble dans les solvants organiques tels que le toluène et le second l'est pas (voir figure 1). La gamme linéaire du dosage a été déterminée empiriquement en utilisant purifiée cadavérine.
Protocol
Discussion
Dans le dosage de la lysine décarboxylase, TNBS réagit avec les amines primaires de L-lysine et la cadavérine pour former le TNP-lysine et la cadavérine TNP-adduits (figure 1). En raison de la présence du groupe acide carboxylique sur le TNP-lysine, cet adduit reste soluble dans l'eau tandis que le TNP-cadavérine, manquant le groupe acide carboxylique, est capable de partitionnement dans le toluène 11. Ce type de test peut être utilisé plus largement sur d'autres types d'acides aminés, o…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Michael Cashel (National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA) pour nous envoyer des souches bactériennes, plasmides, et les protocoles nécessaires. Nous remercions le Dr John Glover (Département de biochimie, Université de Toronto) pour l'utilisation du lecteur de plaque SpecraMax. Royaume-Uni est le destinataire d'un en sciences naturelles et en génie du Canada, bourses d'études supérieures du Canada (CRSNG), les Instituts canadiens de recherche en santé Programme stratégique de formation en biologie structurale des protéines membranaires liées aux maladies, et de l'Université de Toronto Bourse ouverte. Ce travail a été soutenu par une subvention des Instituts canadiens de recherche en santé (MOP-67210) pour WAH.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma Aldrich | P2297 | ||
| 0.1 mM pyridoxal 5′-phosphate (PLP) | Sigma Aldrich | P9255 | ||
| Cadaverine | Sigma Aldrich | D22606 | ||
| 96 well polystyrene plates | Sarstedt | |||
| 96-well quartz plate | Hellma | |||
| VWR Digital Heatblock | VWR | |||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | |||
| 2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen | P-DW-20-C | ||
| Handy Step Repeat Pipettor | Brand | |||
| 12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand (Plastibrand) | 702378 | ||
| SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |
References
- Gale, E. F., Epps, H. M. The effect of the pH of the medium during growth on the enzymic activities of bacteria (Escherichia coli and Micrococcus lysodeikticus) and the biological significance of the changes produced. Biochem J. 36, 600-618 (1942).
- Foster, J. W. Escherichia coli acid resistance: tales of an amateur acidophile. Nat Rev Microbiol. 2, 898-907 (2004).
- Castanie-Cornet, M. P., Penfound, T. A., Smith, D., Elliott, J. F., Foster, J. W. Control of acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 181, 3525-3535 (1999).
- Iyer, R., Williams, C., Miller, C. Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 185, 6556-6561 (2003).
- Sabo, D. L., Boeker, E. A., Byers, B., Waron, H., Fischer, E. H. Purification and physical properties of inducible Escherichia coli lysine decarboxylase. Biochimie. 13, 662-670 (1974).
- Snider, J. Formation of a distinctive complex between the inducible bacterial lysine decarboxylase and a novel AAA+ ATPase. J Biol Chem. 281, 1532-1546 (2006).
- Kashiwagi, K. Coexistence of the genes for putrescine transport protein and ornithine decarboxylase at 16 min on Escherichia coli chromosome. J Biol Chem. 266, 20922-20927 (1991).
- Schneider, G., Kack, H., Lindqvist, Y. The manifold of vitamin B6 dependent enzymes. Structure. 8, 1-6 (2000).
- Cashel, M., Gentry, D. R., Hernandez, V. J., Vinella, D., Curtiss, R., Neidhardt, F. C. . Escherichia coli and Salmonella : cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystrom, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13, 236-242 (2005).
- Phan, A. P., Ngo, T. T., Lenhoff, H. M. Spectrophotometric assay for lysine decarboxylase. Anal Biochem. 120, 193-197 (1982).
- Park, Y. K., Bearson, B., Bang, S. H., Bang, I. S., Foster, J. W. Internal pH crisis, lysine decarboxylase and the acid tolerance response of Salmonella typhimurium. Mol Microbiol. 20, 605-611 (1996).
- Merrell, D. S., Camilli, A. The cadA gene of Vibrio cholerae is induced during infection and plays a role in acid tolerance. Mol Microbiol. 34, 836-849 (1999).
- Kanjee, U., Gutsche, I., Alexopoulos, E., Zhao, B., Bakkouri, M. E. l., Thibault, G., Liu, K., Ramachandran, S., Snider, J., Pai, E. F., Houry, W. A., A, W. Linkage between the Bacterial Acid Stress and Stringent Responses Revealed by the Structure of the Inducible Lysine Decarboxylase. EMBO Journal. 30, 931-944 (2011).
