Productie van biologisch verkregen Injecteerbare Materialen voor myocard Tissue Engineering
Summary
Werkwijzen voor het bereiden een injecteerbare gel matrix van gedecellulariseerde weefsel en het injecteren van het in rat myocardium<em> In vivo</em> Beschreven.
Abstract
Dit protocol biedt methoden voor de bereiding van een injecteerbare extracellulaire matrix (ECM) gel voor myocard tissue engineering toepassingen. In het kort, is gedecellulariseerde weefsel gevriesdroogde, gemalen, enzymatisch verteerd, en vervolgens naar fysiologische pH. Het vriesdrogen verwijdert alle water uit het weefsel, wat resulteert in droge ECM die kunnen tot een fijn poeder gemalen worden met een kleine molen. Na het malen wordt het ECM poeder verteerd met pepsine om een injecteerbare matrix vormen. Na correctie tot pH 7,4, kan het vloeibare matrix-materiaal worden geïnjecteerd in het myocard. Resultaten van eerdere karakterisering assays hebben aangetoond dat matrix gels uit gedecellulariseerde pericardiale en myocardweefsel inheemse ECM componenten, waaronder diverse eiwitten, peptiden en glycosaminoglycanen te behouden. Gezien het gebruik van dit materiaal voor tissue engineering, in vivo karakterisering is vooral nuttig, hier, een methode voor het uitvoeren van een intramurale injectie in de linker ventrikel (LV) vrije wand wordt gepresenteerd als een middel om het analyseren van de gastheer respons op de matrix gel in een klein diermodel. De toegang tot de borstholte wordt verkregen door het diafragma en de injectie wordt gemaakt iets boven de apex in de LV vrije wand. De biologisch verkregen steiger kan worden gevisualiseerd door biotine-labeling vóór de injectie en vervolgens kleuren van het weefsel secties met een mierikswortel peroxidase-geconjugeerde neutravidin en visualiseren via diaminobenzidine (DAB) kleuring. Analyse van de injectie regio kan ook worden gedaan met histologische en immunohistochemische kleuring. Op deze manier werden de eerder onderzochte pericardiale en myocard matrix gels aangetoond dat vezelig, poreuze netwerken te vormen en bloedvatvorming te bevorderen binnen de injectie regio.
Protocol
Discussion
Deze methode maakt het mogelijk voor de productie van biologisch verkregen, injecteerbare steigers voor myocardiale tissue engineering. Hoewel deze methoden werden in eerste instantie ontwikkeld voor de fabricage en in vivo testen van een myocard-matrix gel en hier gepresenteerd met een pericardiale matrix gel, dit protocol kan worden aangepast voor gebruik met elk weefsel, op voorwaarde dat het weefsel juiste manier kan worden gedecellulariseerde. Decellularisatie dient te worden uitgevoerd en voorafgaand aan …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd mede ondersteund door New Innovator Award van de NIH directeur Program, een deel van de NIH Roadmap for Medical Research, de vorm van subsidieovereenkomsten nummer 1-DP2-OD004309-01. SBS-N. wil de NSF bedanken voor een Graduate Research Fellowship.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Reagents: | ||||
| Pepsin | Sigma-Aldrich | p6887-1G | Lyophilized | |
| Biotin | Thermo Scientific | 21217 | ||
| Neutravidin-HRP | Thomas Scientific | 21130 | ||
| Equipment: | ||||
| Wiley Mini Mill | Thomas Scientific | 3383L10 | ||
| Labconco Lyophilizer | Labconco, Inc | 7670520 | ||
| Surgical supplies: | ||||
| Betadine | Purdue Products, L.P. | 67618-154-16 | ||
| Lactated Ringers Solution | MWI | 003966 | ||
| KY Jelly | MWI | 28658 | ||
| Lidocaine, 2% | MWI | 17767 | ||
| Buprenorphine hydrochloride | Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd. | 12496-0757-1 | ||
| Artificial tear ointment | Fisher | NC9860843 | ||
| Triple antibiotic ointment | Fisher | 19082795 | ||
| Isoflurane | MWI | 60307-120-25 | ||
| Otoscope | MWI | 008699 | ||
| Stop cock | MWI | 006245 | ||
| 3-0 Vicrile suture | MWI | J327H | ||
| 5-0 Proline suture | MWI | s-1173 | ||
| Reverse cutting (RC) needle | Ethicon | 8684G | ||
| Microhemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | ||
| Rat tooth microforceps | Fine Science Tools | 11084-07 | ||
| No. 10 scalpel | Fine Science Tools | 10110-01 | ||
| Blunt scissors | Fine Science Tools | 14108-09 | ||
| Sharp, curved scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | ||
| Large, serrated forceps | Fine Science Tools | 1106-12 | ||
| PE160 suction tubing | BD | 427430 | ||
| Clippers | MWI | 21608 | ||
| Skin staples/stapler | Ethicon | PRR35 | ||
| General supplies: | ||||
| Stir plates | ||||
| 0.1 M HCl | ||||
| 1 M NaOH | ||||
| 10x PBS | ||||
| 1x PBS | ||||
| 70% Ethanol | ||||
| 0.1 mL syringes | ||||
| 10 mL syringe | ||||
| Q-tips | ||||
| Surgical glue | ||||
| Surgical drape | ||||
| Towel clamps | ||||
| Small hand-held vacuum |
References
- Seif-Naraghi, S. B., Salvatore, M. A., Magoffin-Schup, P. J., Hu, D. P., Christman, K. L. Design and characterization of an injectable pericardial matrix gel: A potentially autologous scaffold for cardiac tissue engineering. Tissue Engineering. , (2009).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29, 1630-1630 (2008).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3675 (2006).
- Liao, J., Joyce, E. M., Sacks, M. S. Effects of decellularization on the mechanical and structural properties of the porcine aortic valve leaflet. Biomaterials. 29, 1065-1065 (2008).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30, 5409-5409 (2009).
- Christman, K. L., Vardanian, A. J., Fang, Q., Sievers, R. E., Fok, H. H., Lee, R. J. Injectable fibrin scaffold improves cell transplant survival, reduces infarct expansion, and induces neovasculature formation in ischemic myocardium. J Am Coll Cardiol. 44, 654-654 (2004).
- Christman, K. L., Fok, H. H., Sievers, R. E., Fang, Q., Lee, R. J. Fibrin glue alone and skeletal myoblasts in a fibrin scaffold preserve cardiac function after myocardial infarction. Tissue Eng. 10, 403-410 (2004).
- Huang, N. F., Sievers, R. E., Park, J. S., Fang, Q., Li, S., Lee, R. J. A rodent model of myocardial infarction for testing the efficacy of cells and polymers for myocardial reconstruction. Nat Protoc. (1), 1596-1609 (2006).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., Goh, S. K., Black, L. D., Kren, S. M., Netoff, T. I. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
