Méthodes de préparation d'une matrice de gel injectable à partir de tissus décellularisé et l'injecter dans le rat myocarde In vivo Sont décrits.
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Article de méthode
La fabrication des matériaux injectables d'origine biologique pour l'ingénierie tissulaire du myocarde
Dans cet article
Résumé
Résumé
Ce protocole fournit des méthodes pour la préparation d'une injection de la matrice extracellulaire (ECM) de gel pour des applications en génie tissulaire du myocarde. En bref, le tissu décellularisé est lyophilisé, broyé, une digestion enzymatique, puis amené à pH physiologique. La lyophilisation supprime tous les contenus de l'eau à partir des tissus, résultant de l'ECM sec qui peut être broyé en poudre fine avec un petit moulin. Après le broyage, la poudre ECM est digéré par la pepsine pour former une matrice injectable. Après ajustement à un pH de 7,4, le matériau de la matrice liquide peut être injecté dans le myocarde. Résultats des tests de caractérisation précédentes ont montré que les gels matrice produite à partir de tissus décellularisé péricardique et myocardique retenir les composants ECM indigènes, y compris des protéines diverses, des peptides et des glycosaminoglycanes. Compte tenu de l'utilisation de ce matériel pour l'ingénierie tissulaire, la caractérisation in vivo est particulièrement utile, ici, un procédé pour effectuer une injection intra-muros dans le ventricule gauche (VG) paroi libre est présenté comme un moyen d'analyser la réponse de l'hôte de la matrice de gel dans les un modèle animal de petite taille. L'accès à la cavité thoracique est acquise à travers le diaphragme et l'injection est faite légèrement au-dessus de l'apex dans le mur BT libre. L'origine biologique échafaudage peuvent être visualisées par la biotine-étiquetage avant l'injection puis coloration des coupes de tissus avec un raifort conjuguée à la peroxydase et la visualisation via neutravidine diaminobenzidine (DAB) coloration. Analyse de la région d'injection peut aussi être fait avec coloration histologique et immunohistochimique. De cette façon, les gels déjà examiné la matrice péricardique et du myocarde ont été montrés à la forme fibreuse, réseaux poreux et de promouvoir la formation des vaisseaux dans la région d'injection.
Protocole
1. Préparation des tissus pré-traitement
- Avant d'utiliser ce protocole, il faut avoir déjà décellularisé le tissu de votre choix. Pour cet exemple, porcine fraîche et échantillons humains sont péricarde décellularisé d'utiliser un rince hypotonique et hypertonique dans déminéralisée (DI) de l'eau et de sodium dodécyl sulfate (SDS).
- Plus précisément, d'abord laver le péricarde porcin dans l'eau DI pendant 30 minutes, puis remuer en permanence dans 1% de SDS dans le tampon phosphate salin (PBS) pendant 24 heures, suivie d'une eau de 5 heures DI rincer. Pour péricardique humaine, d'abord rincer à l'eau DI pendant 30 minutes, puis remu....
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Discussion
Cette méthode permet la génération d'origine biologique, les échafaudages injectable pour l'ingénierie tissulaire du myocarde. Bien que ces méthodes ont été initialement développées pour la fabrication et des essais in vivo d'un gel de la matrice du myocarde et présenté ici avec une matrice de gel péricardique, ce protocole peut être adapté pour une utilisation avec n'importe quel tissu, pourvu que le tissu peut être appropriée décellularisé. Décellularisation doit être effectuée et vér.......
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Déclarations de divulgation
L'utilisation des animaux: Toutes les expériences dans cette étude ont été effectuées en conformité avec les directives publiées par l'Institutional Animal Care et du Comité Utiliser à l'Université de Californie, San Diego et l'Association américaine pour l'accréditation des soins des animaux de laboratoire.
Remerciements
Cette recherche a été financée en partie par le directeur des NIH Programme Innovateur nouveau prix, le cadre de la Feuille de route du NIH pour la recherche médicale, à travers le numéro de subvention 1-DP2-OD004309-01. SBS-N. tiens à remercier la NSF pour une bourse de recherche de deuxième cycle.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Réactifs : | |||
| Pepsine | Sigma-Aldrich | p6887-1G | Liofilisé |
| Biotine | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21217 | |
| Neutravidine-HRP | Thomas Scientific | 21130 | |
| Équipement : | |||
| Wiley Mini Mill | Thomas Scientific | 3383L10 | |
| Lyophilisateur Labconco | Labconco Corp. | 7670520 | |
| Matériel chirurgical : | |||
| Bétadine | Purdue Products L.P. | 67618-154-16 | |
| Solution de Ringer lactatée | MWI Veterinary Supply | 003966 | |
| KY Jelly | MWI Veterinary Supply | 28658 | |
| Lidocaïne, 2 % | MWI Veterinary Supply | 17767 | |
| Chlorhydrate de buprénorphine | Reckitt Benckiser | 12496-0757-1 | |
| Pommade ophtalmique artificielle | Fisher Scientific | NC9860843 | |
| Pommade antibiotique triple | Fisher Scientific | 19082795 | |
| Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 60307-120-25 | |
| Otoscope | MWI Veterinary Supply | 008699 | |
| Robinet trois voies | MWI Veterinary Supply | 006245 | |
| Filet de suture Vicryl 3-0 | MWI Veterinary Supply | J327H | |
| Filet de suture Proline 5-0 | MWI Veterinary Supply | s-1173 | |
| Aiguille courbe à tranchant inversé (RC) | Ethicon Inc. | 8684G | |
| Micropinces hémostatiques | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Pinces micro-dentées | Fine Science Tools | 11084-07 | |
| Lame de scalpel n° 10 | Fine Science Tools | 10110-01 | |
| Ciseaux émoussés | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| Ciseaux courbes pointus | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Grosses pinces crantées | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| Tuyau d'aspiration PE160 | BD Biosciences | 427430 | |
| Tondeuses | MWI Veterinary Supply | 21608 | |
| Staples/stapleuse chirurgicaux | Ethicon Inc. | PRR35 | |
| Matériel général : | |||
| Agitateurs magnétiques | |||
| HCl 0,1 M | |||
| NaOH 1 M | |||
| PBS 10x | |||
| PBS 1x | |||
| Éthanol 70 % | |||
| Seringues de 0,1 mL | |||
| Seringue de 10 mL | |||
| Q-tips | |||
| Colle chirurgicale | |||
| Champ opératoire | |||
| Pinces de fixation | |||
| Petit aspirateur portable |
Références
- Seif-Naraghi, S. B., Salvatore, M. A., Magoffin-Schup, P. J., Hu, D. P., Christman, K. L. Design and characterization of an injectable pericardial matrix gel: A potentially autologous scaffold for cardiac tissue engineering. Tissue Engineering. , (2009).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F.
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Réimpressions et autorisations
