ייצור של חומרים בזריקות נגזר ביולוגית של הנדסת רקמות שריר הלב
Summary
שיטות להכנת ג'ל מטריצה בזריקות מרקמות decellularized והזרקת אותו לתוך שריר הלב חולדה<em> In vivo</em> מתוארים.
Abstract
פרוטוקול זה מספק שיטות להכנת ג'ל בזריקות תאית (ECM) מטריצה עבור יישומי הנדסה רקמת שריר הלב. בקצרה, היא רקמה decellularized lyophilized, הסתובבו, מתעכל enzymatically, והביא אז pH פיזיולוגי. Lyophilization מסיר את כל התוכן מים מן הרקמה, וכתוצאה מכך ECM יבש שניתן האדמה לאבקה דקה עם מפעל קטן. לאחר טחינה, אבקת ECM מתעכל עם פפסין להקים מטריצה להזרקה. לאחר תקנון ל-pH 7.4, חומר נוזלי מטריצה יהיה ניתן להזריק לתוך שריר הלב. תוצאות של מבחני אפיון קודמים הראו כי המטריצה ג'לים המופק רקמות decellularized קרום הלב ואת שריר הלב לשמור רכיבים ECM הילידים, כולל חלבונים, פפטידים מגוונים glycosaminoglycans. לאור השימוש בחומר זה עבור הנדסת רקמות, באפיון vivo שימושית במיוחד; כאן, שיטה לביצוע זריקה עירונית לתוך החדר השמאלי (LV) קיר פנוי מוצג כאמצעי ניתוח התגובה לארח הג'ל מטריקס מודל חיה קטנה. גישה חלל החזה הוא צבר דרך הסרעפת ואת הזריקה נעשית מעט מעל לשיא בקיר LV חינם. פיגום ביולוגי נגזר ניתן דמיינו ידי תיוג-ביוטין לפני הזריקה ולאחר מכן מכתים סעיפים רקמה עם צנון סוס peroxidase-מצומדות neutravidin באופן חזותי באמצעות מכתים (DAB) diaminobenzidine. ניתוח באזור ההזרקה יכולה להיעשות גם עם צביעה היסטולוגית ו immunohistochemical. בדרך זו, הג'לים נבדק בעבר מטריצה קרום הלב ואת שריר הלב הוצגו בצורה סיבי, רשתות נקבוביים לקדם היווצרות כלי בתוך האזור ההזרקה.
Protocol
Discussion
שיטה זו מאפשרת לדור של פיגומים נגזר ביולוגי הניתן להזרקה לצורך הנדסת רקמות שריר הלב. אמנם בשיטות אלו פותחו בתחילה עבור ייצור ו בבדיקת vivo של ג'ל מטריצה שריר הלב המוצג כאן עם ג'ל מטריצה קרום הלב, בפרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשימוש עם רקמה, בתנאי הרקמה ני…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן בחלקו על ידי ניו תוכנית המנהל של NIH ממציא פרס, במסגרת מפת הדרכים NIH למחקר רפואי, באמצעות מספר מענק 1-DP2-OD004309-01. SBS-N. רוצה להודות ה-NSF עבור מלגת מחקר לתארים מתקדמים.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Reagents: | ||||
| Pepsin | Sigma-Aldrich | p6887-1G | Lyophilized | |
| Biotin | Thermo Scientific | 21217 | ||
| Neutravidin-HRP | Thomas Scientific | 21130 | ||
| Equipment: | ||||
| Wiley Mini Mill | Thomas Scientific | 3383L10 | ||
| Labconco Lyophilizer | Labconco, Inc | 7670520 | ||
| Surgical supplies: | ||||
| Betadine | Purdue Products, L.P. | 67618-154-16 | ||
| Lactated Ringers Solution | MWI | 003966 | ||
| KY Jelly | MWI | 28658 | ||
| Lidocaine, 2% | MWI | 17767 | ||
| Buprenorphine hydrochloride | Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd. | 12496-0757-1 | ||
| Artificial tear ointment | Fisher | NC9860843 | ||
| Triple antibiotic ointment | Fisher | 19082795 | ||
| Isoflurane | MWI | 60307-120-25 | ||
| Otoscope | MWI | 008699 | ||
| Stop cock | MWI | 006245 | ||
| 3-0 Vicrile suture | MWI | J327H | ||
| 5-0 Proline suture | MWI | s-1173 | ||
| Reverse cutting (RC) needle | Ethicon | 8684G | ||
| Microhemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | ||
| Rat tooth microforceps | Fine Science Tools | 11084-07 | ||
| No. 10 scalpel | Fine Science Tools | 10110-01 | ||
| Blunt scissors | Fine Science Tools | 14108-09 | ||
| Sharp, curved scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | ||
| Large, serrated forceps | Fine Science Tools | 1106-12 | ||
| PE160 suction tubing | BD | 427430 | ||
| Clippers | MWI | 21608 | ||
| Skin staples/stapler | Ethicon | PRR35 | ||
| General supplies: | ||||
| Stir plates | ||||
| 0.1 M HCl | ||||
| 1 M NaOH | ||||
| 10x PBS | ||||
| 1x PBS | ||||
| 70% Ethanol | ||||
| 0.1 mL syringes | ||||
| 10 mL syringe | ||||
| Q-tips | ||||
| Surgical glue | ||||
| Surgical drape | ||||
| Towel clamps | ||||
| Small hand-held vacuum |
References
- Seif-Naraghi, S. B., Salvatore, M. A., Magoffin-Schup, P. J., Hu, D. P., Christman, K. L. Design and characterization of an injectable pericardial matrix gel: A potentially autologous scaffold for cardiac tissue engineering. Tissue Engineering. , (2009).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29, 1630-1630 (2008).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3675 (2006).
- Liao, J., Joyce, E. M., Sacks, M. S. Effects of decellularization on the mechanical and structural properties of the porcine aortic valve leaflet. Biomaterials. 29, 1065-1065 (2008).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30, 5409-5409 (2009).
- Christman, K. L., Vardanian, A. J., Fang, Q., Sievers, R. E., Fok, H. H., Lee, R. J. Injectable fibrin scaffold improves cell transplant survival, reduces infarct expansion, and induces neovasculature formation in ischemic myocardium. J Am Coll Cardiol. 44, 654-654 (2004).
- Christman, K. L., Fok, H. H., Sievers, R. E., Fang, Q., Lee, R. J. Fibrin glue alone and skeletal myoblasts in a fibrin scaffold preserve cardiac function after myocardial infarction. Tissue Eng. 10, 403-410 (2004).
- Huang, N. F., Sievers, R. E., Park, J. S., Fang, Q., Li, S., Lee, R. J. A rodent model of myocardial infarction for testing the efficacy of cells and polymers for myocardial reconstruction. Nat Protoc. (1), 1596-1609 (2006).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., Goh, S. K., Black, L. D., Kren, S. M., Netoff, T. I. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
