Studie gliacellsmarkörer Heterogenitet Påverkan på Axon tillväxt Använda ett nytt Coculture metod
Summary
I detta protokoll beskrivs vi en ny metod för att studera inverkan av gliacellsmarkörer heterogenitet på axon tillväxt med en<em> In vitro</em> Co-kultur-system. Rat kortikala gliaceller odlades till sammanflödet och cocultured med renat råtta dorsala neuron rotganglier. Olika gliacellsmarkörer påverkan på nervceller vidhäftning och axon tillväxt jämfördes direkt i samma kultur. Denna metod ger ett nytt sätt att direkt studera gliaceller inflytande cellen heterogenitet på neuron vidhäftning och Axon tillväxt.
Abstract
I det centrala nervsystemet hos alla däggdjur, avhuggna axoner efter skada inte kan förnya sina ursprungliga mål och funktionell återhämtning är mycket dålig 1. Felet av Axon förnyelse är en kombinerad resultatet av flera faktorer, inklusive fientliga gliacellsmarkörer miljö, hämmande myelin relaterade molekyler och minskade inneboende neuron regenerativ kapacitet 2. Astrocyterna är de mest dominerande gliaceller celltyp i centrala nervsystemet och spelar en viktig roll i axonet uppdrag enligt fysiologi och patologi villkor 3. Kontrast till den homologa oligodendrocyter, astrocyter är en heterogen cellpopulation består av olika astrocyternas subpopulationer med olika morfologier och genuttryck 4. Den funktionella betydelsen av denna heterogenitet, till exempel deras påverkan på Axon tillväxten är i stort sett okänd.
För att studera gliacellsmarkörer, speciellt funktion astrocyternas heterogenitet i neuron beteende har vi etablerat en ny metod genom samtidig odling renat hög rygg nervceller rotganglier med gliaceller från råttan cortex. Genom denna teknik kunde vi direkt jämföra neuron vidhäftning och axon tillväxt på olika astrocyter delpopulationer på samma villkor.
I denna rapport ger vi den detaljerade protokoll av denna metod för astrocyter isolering och kultur, dorsala nervceller ganglier isolering och rening, samt co-kultur DRG nervceller med astrocyter. Denna metod skulle även kunna utvidgas till andra delar av hjärnan för att studera cellulära eller regionala specifika interaktionen mellan nervceller och gliaceller.
Protocol
Discussion
Detta experiment protokoll var utformad för att nå två mål för att studera gliaceller, speciellt astrocyternas heterogenitet påverkan på neuron vidhäftning och neurite tillväxt. Det första målet var att upprätthålla astrocyternas heterogenitet så mycket som möjligt, i detta experiment var konfluenta gliacellsmarkörer kultur berikat astrocyter blandade primära kulturen utan kemisk behandling och rötning spridning, vilket ytterligare kan skada cellen och orsaka skador svar astrocyter. Den slutliga astroc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av FMMU nya finna grunden och delvis NIH finansiering.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM(high glucose) | Invitrogen | 10313-039 | ||
| L15 medium | Invitrogen | 11415-114 | ||
| FBS | Invitrogen | 10437-077 | ||
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | ||
| poly-lysine | Sigma | P4832 | culture grade | |
| NGF(2.5S) | Invitrogen | 13257-019 | ||
| B27 supplyment | Invitrogen | 17504-044 | ||
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-056 | ||
| FUDR | Sigma | F0503 | ||
| neurofilament antibody | Abcam | ab24575 |
References
- Rossignol, S., Schwab, M., Schwartz, M., Fehlings, M. G. Spinal cord injury: time to move?. J Neurosci. 27 (44), 11782-11792 (2007).
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Matyash, V., Kettenmann, H. Heterogeneity in astrocyte morphology and physiology. Brain Res Rev. , (2009).
- Wanner, I. B., Deik, A., Torres, M., Rosendahl, A., Neary, J. T., Lemmon, V. P., Bixby, J. L. A new in vitro model of the glial scar inhibits axon growth. Glia. 56 (15), 1691-1709 (2008).
- Kuffler, D. P., Sosa, I. J., Reyes, O. Schwann cell chondroitin sulfate proteoglycan inhibits dorsal root ganglion neuron neurite outgrowth and substrate specificity via a soma and not a growth cone mechanism. J Neurosci Res. 87 (13), 2863-2871 (2009).
- Kleitman, N., Wood, P. M., Bunge, R. P. Tissue culture method for the study of myelination. Culturing nerve cells. , P559-P559 (1998).
