Gramicidine op basis van fluorescentie test, voor het bepalen van kleine moleculen Potentieel voor het wijzigen van lipide bilaag Properties
Summary
We introduceren een snelle fluorescentie-gebaseerde test die de mate van fluorescentie quenching als een maat voor gramicidine kanaal activiteit monitoren. De gramicidine kanalen worden gebruikt als moleculaire krachtopnemers op veranderingen in de lipide bilaag eigenschappen als waargenomen door bilaag spanning eiwitten controleren.
Abstract
Veel geneesmiddelen en andere kleine moleculen die gebruikt worden voor het moduleren van biologische functie zijn amfifielen dat adsorberen aan de bilaag / oplossing interface en daardoor lipide bilaag eigenschappen te veranderen. Dit is belangrijk omdat membraaneiwitten zijn energetisch gekoppeld aan hun gastheer bilaag door hydrofobe interacties. Veranderingen in de bilaag eigenschappen zo te veranderen membraaneiwit functie, die een indirecte manier voor amfifielen te moduleren eiwit functie en een mogelijk mechanisme voor de "off-target" drug effecten biedt. We hebben eerder ontwikkelde een elektrofysiologische test voor het detecteren van veranderingen in de lipide bilaag eigenschappen met behulp van lineaire gramicidine kanalen als probes 3,12. Gramicidine kanalen zijn mini-eiwitten gevormd door de transbilayer dimerisatie van twee niet-geleidende subunits. Ze zijn gevoelig voor veranderingen in hun membraan omgeving, waardoor ze krachtig probes voor het monitoren van veranderingen in de lipide bilaag eigenschappen als waargenomen door bilaag spanning eiwitten. We hebben nu laten zien een fluorescentie assay voor het detecteren van veranderingen in de bilaag eigenschappen met behulp van dezelfde kanalen als probes. De test is gebaseerd op het meten van het tijdsverloop van de fluorescentie quenching van de fluorofoor-loaded grote unilamellaire blaasjes te wijten aan het binnendringen van een quencher via de gramicidine kanalen. We gebruiken de fluorescentie-indicator / quencher paar 8-Aminonaftaleen-1 ,3,6-trisulfonate (mieren) / Tl + die met succes is gebruikt in andere fluorescentie quenching assays 5,13. Tl + doordringt de lipide bilaag langzaam acht, maar passeert gemakkelijk door het uitvoeren van gramicidine kanalen 1,14. De methode is schaalbaar en geschikt voor zowel mechanistische studies en high-throughput screening van kleine moleculen voor bilaag-storende, en potentiële "off-target ', effecten. We vinden dat de resultaten met deze methode zijn in goede overeenstemming met eerdere elektrofysiologische resultaten 12.
Protocol
Discussion
We hebben aangetoond dat een snelle fluorescentie-gebaseerde test voor het bepalen van de bilaag wijzigen potentieel van drugs en andere kleine amfifielen. Verbindingen die bilaag eigenschappen te wijzigen zijn waarschijnlijk membraan eiwitten functioneren in een indirecte, niet-specifieke manier te veranderen, eventueel bij te dragen aan "off-target" drug-effecten. De test maakt gebruik van de kracht van gramicidine kanalen als probes voor de veranderingen in de bilaag eigenschappen van 12 die word…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Michael J. Bruno, Radda Rusinova en Jon T. Sack voor vele stimulerende discussies. De financiële steun van NIH, R01GM021342 en ARRA vullen R01GM021342-35S1 en de Josia Macy, Jr Stichting OSA, de Tri-I CMB programma voor HII, en de Iris L. en S. Woodworth Leverett Medical Fellowship Scientist en NIH MSTP verlenen GM07739 voor RK.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| ANTS | Invitrogen | A-350 | ||
| gramicidin | Sigma Chemical Co | G-5002 | ||
| 1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850398C | ||
| Mini-Extruder kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | ||
| PD-10 Desalting column | Sigma-Aldrich Made by GE Healthcare | 54805 |
References
- Andersen, O. S., Giebisch, G. H., Purcel, E. F. Ion transport through simple membranes. Renal Function. , (1978).
- Andersen, O. S., Koeppe, R. E. Bilayer thickness and membrane protein function: An energetic perspective. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 107-130 (2007).
- Andersen, O. S., Koeppe, R. E., Roux, B., Chung, S. -. H., Andersen, O. S., Krishnamurthy, V. Gramicidin channels. Versatile tools. Biological Membrane Ion Channels: Dynamics, Structure, and Applications. , (2007).
- Berberan-Santos, M. N., Bodunov, E. N., Valeur, B. Mathematical functions for the analysis of luminescence decays with underlying distributions 1. Kohlrausch decay function (stretched exponential. Chem. Phys. 315, 171-182 (2005).
- Bruggemann, E. P., Kayalar, C. Determination of the molecularity of the colicin E1 channel by stopped-flow ion flux kinetics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 4273-4276 (1986).
- Bruno, M. J., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Docosahexaenoic acid alters bilayer elastic properties. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 9638-9643 (2007).
- Buboltz, J. T., Feigenson, G. W. A novel strategy for the preparation of liposomes: rapid solvent exchange. Biochim. Biophys. Acta. 1417, 232-245 (1999).
- Gutknecht, J. Cadmium & thallous ion permeabilities through lipid bilayer membranes. Biochim. Biophys. Acta. 735, 185-188 (1983).
- Ingólfsson, H. I., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Curcumin is a modulator of bilayer material properties. Biochimie. 46, 10384-10391 (2007).
- Keserü, G. M., Makara, G. M. The influence of lead discovery strategies on the properties of drug candidates. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 203-212 (2009).
- Leeson, P. D., Springthorpe, B. The influence of drug-like concepts on decision-making in medicinal chemistry. Nat. Rev. Drug Discov. 6, 881-890 (2007).
- Lundb k, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S., S, O. Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes. J. R. Soc. Interface. 7, 373-395 (2010).
- Moore, H. P. &. a. m. p. ;. a. m. p., Raftery, M. A. Direct spectroscopic studies of cation translocation by Torpedo acetylcholine receptor on a time scale of physiological relevance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77, 4509-4513 (1980).
- Neher, E. Ionic specificity of the gramicidin channel and the thallous ion. Biochim. Biophys. Acta. 401, 540-544 (1975).
- O’Connell, A. M., Koeppe, R. E., Andersen, O. S. Kinetics of gramicidin channel formation in lipid bilayers: transmembrane monomer association. Science. 250, 1256-1259 (1990).
- Søgaard, R. GABAA receptor function is regulated by lipid bilayer elasticity. Biochimie. 45, 13118-13129 (2006).
- Waring, M. J. Defining optimum lipophilicity and molecular weight ranges for drug candidates-Molecular weight dependent lower logD limits based on permeability. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2844-2851 (2009).
