グラミシジンベースの蛍光アッセイ、脂質二重層のプロパティの変更の可能性小分子を決定するための
Summary
我々は、グラミシジンチャネル活性の尺度としての蛍光消光の速度を監視し、高速蛍光ベースのアッセイをご紹介。グラミシジンのチャンネルは、タンパク質にまたがる二重層により検知されたとして、脂質二重層の特性の変化を監視するための分子力変換器として使用されています。
Abstract
多くの薬と生物学的機能を調節するために使用される他の小さな分子は両親媒性脂質二重層/溶液界面のその吸着であり、それによって脂質二重層のプロパティを変更する。膜タンパク質がエネルギー的に疎水性相互作用によって、そのホストの二重層に結合されているため、これは重要です。二重層の特性の変化は、このように両親媒性物質は、タンパク質の機能と"オフターゲット"薬の効果の可能なメカニズムを変調するための間接的な方法を提供する、膜タンパク質の機能を変化させる。我々は以前のプローブ3,12のような線形グラミシジンのチャンネルを使用して、脂質二重層の特性の変化を検出するための電気生理学的ア ッセイを開発した。グラミシジンのチャンネルは2つの非導電性サブユニットのtransbilayer二量体化によって形成されるミニ蛋白質である。彼らはそれらのタンパク質にまたがる二重層により検知されたとして、脂質二重層の特性の変化を監視するための強力なプローブになる彼らの膜環境の変化に敏感です。我々は現在、プローブと同じチャンネルを使用して二重層の特性の変化を検出するための蛍光アッセイを示す。アッセイは、グラミシジンのチャンネルを通じて、クエンチャーのエントリに起因する蛍光体にロードされた大きな単ラメラ小胞からの蛍光消光の時間経過を測定することに基づいています。我々は、蛍光指示薬/消光剤ペア8 -アミノナフタレン-1,3,6 – trisulfonate（ANTS）/ TL +を正常他の蛍光消光アッセイ5,13で使用されている使用してください。 TL +はゆっくり8脂質二重層に浸透がグラミシジンのチャンネル1,14を実施を通じて容易に通過する。このメソッドは、両方の効果機序の研究と二重層-摂動のための小分子のハイスループットスクリーニング、および潜在的な"オフターゲット"のための拡張性と最適です。我々は、このメソッドを使用して結果が以前の電気生理学的結果12とよく一致していることがわかります。
Protocol
Discussion
私たちは、麻薬や他の小さな両親媒性物質の二重層変更の可能性を決定するための高速な蛍光ベースのアッセイを実証している。二重層のプロパティを変更する化合物は、おそらく"オフターゲット"薬の効果に貢献し、間接的、非特異的に膜タンパク質の機能を変更する可能性があります。アッセイは、二重層貫通タンパク質によって感知される二層プロパティの変更12の…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、多くの刺激的な議論のためにマイケルJ.ブルーノ、ラッダRusinovaとジョンT.サックに感謝。 NIH、R01GM021342とARRAサプリメントR01GM021342 – 35S1、及びOSAのジョサイアメイシー、ジュニア財団からの財政支援、トライ- I HII用CMBプログラム、およびアイリスL.とレヴェレットS.ウッドワース医学者フェローシップとNIH MSTP助成金RK用GM07739。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| ANTS | Invitrogen | A-350 | ||
| gramicidin | Sigma Chemical Co | G-5002 | ||
| 1,2-dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850398C | ||
| Mini-Extruder kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | ||
| PD-10 Desalting column | Sigma-Aldrich Made by GE Healthcare | 54805 |
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