Expressão, solubilização, detergente e Purificação de um transportador de membrana, as proteínas MexB resistência a múltiplas drogas
Summary
Neste protocolo que demonstram a expressão, solubilização e purificação de uma proteína de membrana recombinantemente expressas, MexB, como um complexo proteína solúvel detergente. MexB é um transportador de membrana multirresistência do oportunista Pseudomonas aeruginosa bacteriana patogênica.
Abstract
Multirresistência (MDR), a capacidade de uma célula cancerosa ou patógeno para ser resistente a uma ampla variedade de estrutural e funcionalmente não relacionados drogas anti-câncer ou antibióticos, é um problema atual graves na saúde pública. Esta resistência a múltiplas drogas é em grande parte devido à energia dependente de bombas de efluxo de drogas. As bombas de expulsar drogas anti-câncer ou antibióticos para o meio externo, reduzindo sua concentração intracelular abaixo de um limiar tóxico. Estamos estudando a resistência a múltiplas drogas em Pseudomonas aeruginosa, um patógeno oportunista que causa infecções bacterianas em pacientes com diversos tipos de lesões ou doença, por exemplo, queimaduras ou fibrose cística, e também em imuno-comprometidos diálise, câncer e pacientes transplantados. As bombas de efluxo MDR grandes em P. aeruginosa são complexos tripartite composta por uma membrana interna antiporter prótons drogas (RND), um canal de membrana externa (OMF), e uma proteína linker periplasmic (MFP) 1-8. As proteínas RND e OMF são proteínas transmembrana. Proteínas transmembrana formam mais de 30% de todas as proteínas e são 65% dos alvos de drogas atual. Os domínios transmembrana hidrofóbica fazer as proteínas insolúveis em tampão aquoso. Antes de uma proteína transmembrana pode ser purificado, é necessário encontrar condições tampão contendo um detergente suave que permitem que a proteína seja solubilizada como um complexo de proteína de detergente (PDC) 11/09. Neste exemplo, usamos uma proteína RND, o P. aeruginosa transportador transmembrana MexB, para demonstrar a forma de expressar uma forma recombinante da proteína transmembrana, solubilizar-lo usando os detergentes, em seguida, purificar o detergente complexos de proteína. Este método geral pode ser aplicado à expressão, purificação e solubilização de muitas outras proteínas da membrana recombinantemente expressas. Os complexos de proteína detergente pode ser usado posteriormente para a caracterização bioquímica ou biofísica, incluindo raios-X a determinação da estrutura de cristal ou estudos de reticulação.
Protocol
Discussion
Além de multirresistência, muitas atividades vitais celulares, incluindo ion transporte, comunicação célula-célula, transporte de vesículas, a manutenção da estrutura celular e Interações Hospedeiro-Patógeno, envolvem proteínas que são incorporados na membrana da célula. Proteínas transmembrana formam mais de 30% de proteínas conhecidas e são as metas para a maioria dos fármacos em uso hoje. O dobramento imprópria ou atividade das proteínas transmembrana levar a importantes doenças genéticas, incl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projeto foi suportado por concessões para CJJ da National Science Foundation e pela Sociedade de Ciências Biomolecular.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SDS sample buffer | Biorad | 161-0737 | ||
| C43(DE3) E. coli strain | Lucigen | 60345-1 | ||
| kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | ||
| 2XYT media | Fisher | BP2466-2 | ||
| LB media | Fisher | AC61189-5000 | ||
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | ||
| DNaseI | Fisher | BP3226-1 | ||
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | ||
| Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche | 11 873 580 001 | ||
| NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | ||
| NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | ||
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | ||
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | ||
| 15ml tubes | Corning | 430052 | ||
| See-Saw Rocker | Fisher | SSL 4 | ||
| Talon metal affinity resin | Clontech | 635503 | ||
| imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | ||
| 10% polyacrylamide SDS PAGE gels | BioRad | 161-1454 | ||
| Tris/glycine/SDS PAGE running buffer | BioRad | 161-0732 | ||
| Kaleidascope prestained molecular weight markers | BioRad | 161-0324 | ||
| Superose 12 30/10 column | GEHealthcareSuperose | 12 10/300 GL | ||
| Amicon centrifugal concentrator | Millipore | UFC801024 | ||
| Syringe filter | Fisher | SLFG R04 NL | ||
| Fernbach flasks | Fisher | 09-552-39 | ||
| Shaker to hold Fernbach flasks | Fisher Scientific | |||
| Akta system | GE Healthcare | |||
| J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor | Beckman | |||
| 1 l centrifuge bottles | Beckman | 969329 | ||
| RC-5 centrifuge | ThermoScientific | |||
| SS34 fixed-angle rotor and tubes | ThermoScientific | |||
| Sorvall floor model Ultracentrifuge | ThermoScientific | |||
| T647.5 rotor and tubes with caps | ThermoScientific | 08322 | ||
| French Pressure Cell | ThermoScientific | FA-032 |
References
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