Выражение, детергентов солюбилизации и очистки Мембранные Transporter, сопротивление MexB множественной лекарственной белка
Summary
В этом протоколе мы демонстрируем выражения, солюбилизации и очистки рекомбинантно выразил мембранный белок, MexB, как растворимый комплекс моющих средств белка. MexB является множественной лекарственной транспортер сопротивление мембраны от оппортунистических бактериальных патогенов синегнойной палочкой.
Abstract
Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ), способность раковых клеток или возбудителя устойчивы к широкому кругу структурно и функционально не связанных противораковых препаратов или антибиотиков, в настоящее время является серьезной проблемой в области общественного здравоохранения. Это множественная лекарственная устойчивость во многом объясняется энергозависимых насосов наркотиков истечения. Насосы изгнать противораковых препаратов или антибиотиков во внешнюю среду, снижая их внутриклеточной концентрации ниже токсичного порога. Мы изучаем множественной лекарственной устойчивостью в синегнойной палочки, оппортунистических бактериальный возбудитель, который вызывает инфекции у больных со многими типами травмы или болезни, например, ожогов или кистозный фиброз, а также в с ослабленным иммунитетом рака, диализа и трансплантации пациентам. Основные MDR откачивающих в P. палочки являются трехсторонние комплексы состоят из внутренней оболочки протона с наркотиками антипортера (РНД), внешний канал мембраны (OMF), а периплазматического белка компоновщика (МФУ) 1-8. РНД и OMF белки трансмембранных белков. Трансмембранных белков составляют более 30% всех белков и 65% от текущей лекарственных препаратов. Гидрофобных трансмембранных доменов делают белки нерастворимы в водном буфере. Перед трансмембранный белок может быть очищена, необходимо найти буфера условиях, содержащих мягкого моющего средства, которые позволяют белка в раствор, как белковый комплекс моющих средств (PDC) 9-11. В этом примере мы используем RND белка, П. палочки MexB трансмембранного транспортер, чтобы продемонстрировать, как выразить рекомбинантная форма трансмембранного белка, растворить его, используя моющие средства, а затем очистить белковых комплексов моющего средства. Этот общий метод может быть применен к выражению, очистка и солюбилизации многих других рекомбинантно выразил мембранных белков. Белковых комплексов моющего средства в дальнейшем могут быть использованы для биохимических и биофизических характеристик в том числе рентгеноструктурного определения структуры или сшивания исследований.
Protocol
Discussion
В дополнение к лекарственной устойчивости, многие жизненно важные клеточной активности, в том числе транспорт ионов, межклеточной коммуникации, транспорт везикул, поддержание клеточной структуры, а хозяин-патоген взаимодействия, связаны с белками, которые встраиваются в клеточные ме…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект был поддержан грантами для CJJ от Национального научного фонда и Общества биомолекулярных наук.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SDS sample buffer | Biorad | 161-0737 | ||
| C43(DE3) E. coli strain | Lucigen | 60345-1 | ||
| kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | K4378 | ||
| 2XYT media | Fisher | BP2466-2 | ||
| LB media | Fisher | AC61189-5000 | ||
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | ||
| DNaseI | Fisher | BP3226-1 | ||
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | ||
| Complete EDTA-free protease inhibitor tablets | Roche | 11 873 580 001 | ||
| NaP monobasic | Sigma-Aldrich | S6566 | ||
| NaP dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | ||
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | ||
| n-dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310 | ||
| 15ml tubes | Corning | 430052 | ||
| See-Saw Rocker | Fisher | SSL 4 | ||
| Talon metal affinity resin | Clontech | 635503 | ||
| imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | ||
| 10% polyacrylamide SDS PAGE gels | BioRad | 161-1454 | ||
| Tris/glycine/SDS PAGE running buffer | BioRad | 161-0732 | ||
| Kaleidascope prestained molecular weight markers | BioRad | 161-0324 | ||
| Superose 12 30/10 column | GEHealthcareSuperose | 12 10/300 GL | ||
| Amicon centrifugal concentrator | Millipore | UFC801024 | ||
| Syringe filter | Fisher | SLFG R04 NL | ||
| Fernbach flasks | Fisher | 09-552-39 | ||
| Shaker to hold Fernbach flasks | Fisher Scientific | |||
| Akta system | GE Healthcare | |||
| J6 Large scale centrifuge with JLA-8.1000 rotor | Beckman | |||
| 1 l centrifuge bottles | Beckman | 969329 | ||
| RC-5 centrifuge | ThermoScientific | |||
| SS34 fixed-angle rotor and tubes | ThermoScientific | |||
| Sorvall floor model Ultracentrifuge | ThermoScientific | |||
| T647.5 rotor and tubes with caps | ThermoScientific | 08322 | ||
| French Pressure Cell | ThermoScientific | FA-032 |
References
- Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space. J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).
- Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H. Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to beta-lactam resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1742-1752 (1994).
- Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1948-1953 (1995).
- Masuda, N., Sakagawa, E., Ohya, S., Gotoh, N., Tsujimoto, H., Nishino, T. Substrate specificities of MexAB-OprM, MexCD-OprJ, and MexXY-oprM efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3322-3327 (2000).
- Okusu, H., Ma, D., Nikaido, H. AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants. J. Bacteriol. 178, 306-308 (1996).
- Srikumar, R., Kon, T., Gotoh, N., Poole, K. Expression of Pseudomonas aeruginosa multidrug efflux pumps MexA-MexB-OprM and MexC-MexD-OprJ in a multidrug-sensitive Escherichia coli strain. Antimicrob. Agents Chemother. 42, 65-71 (1998).
- Tikhonova, E. B., Zgurskaya, H. I. AcrA, AcrB, and TolC of Escherichia coli Form a Stable Intermembrane Multidrug Efflux. Complex. J. Biol. Chem. 279, 32116-3224 (2004).
- Yoneyama, H., Ocakatan, A., Tsuda, M., Nakae, T. The role of mex-gene products in antibiotic extrusion in Pseudomonas aeruginosa. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 611-618 (1997).
- Berger, B. W., Gendron, C. M., Robinson, C. R., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. The role of protein and surfactant interactions in membrane-protein crystallization. Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 61, 724-730 (2005).
- Jones, M. Surfactants in membrane solubilisation. Int. J. Pharm. 177, 137-159 (1999).
- Maire, M. l. e., Champeil, P., Moller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochim. Biophys. Acta. 1508, 86-111 (2000).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260, 289-298 (1996).
