Iniezione intracranica di adeno-associato vettori virali
Summary
Qui vi presentiamo l'iniezione intracranica di vettori AAV per la marcatura fluorescente di neuroni e glia nella corteccia visiva.
Abstract
Intracranica iniezione di vettori virali ingegnerizzati per esprimere una proteina fluorescente è una tecnica di etichettatura versatile per la visualizzazione di sottoinsiemi di cellule nelle differenti regioni del cervello sia in vivo che in sezioni cerebrali. A differenza della iniezione di coloranti fluorescenti, etichettatura virale offre targeting di tipi di cellule individuali ed è meno costoso e richiede tempo che stabilire linee di topi transgenici. In questa tecnica, un virale adeno-associato (AAV) vettore viene iniettato intracranially usando le coordinate stereotassica, una micropipetta e una pompa automatica per la consegna precisa AAV alla zona desiderata con minimo danno al tessuto circostante. Parametri di iniezione può essere adattata alle singole sperimentazioni regolando l'età degli animali a velocità di iniezione, la posizione di iniezione, il volume di iniezione, di iniezione, AAV sierotipo e il promotore di guida l'espressione genica. A seconda delle condizioni scelte, virale indotta l'espressione del transgene può permettere la visualizzazione di gruppi di cellule, cellule singole o multa processi cellulari, fino al livello delle spine dendritiche. L'esperimento qui rappresenta una iniezione di AAV a doppio filamento che esprimono la proteina fluorescente verde per l'etichettatura dei neuroni e glia nella corteccia visiva primaria del mouse.
Protocol
Discussion
Virale mediata consegna del gene ha un grande potenziale per lo studio di processi neurologici e trattamento dei disturbi cerebrali 1,2,3. La grande versatilità di questa tecnica può anche essere sfruttato per un'etichetta fluorescente cellule per l'imaging sia in vitro che in vivo 4. Qui mostriamo una procedura dettagliata per la trasduzione di neuroni e glia nella corteccia visiva del mouse utilizzando un doppio filamento del virus adeno-associazione che esprime maggiore protei…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato reso possibile da finanziamenti del NIH (EY012977), un Premio alla Carriera nel Scienze Biomediche dal Fondo Burroughs Wellcome, la Fondazione Whitehall, e la Fondazione Sloan (AKM).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Stoelting Mouse and Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51625 | Regular stereotax for securing animals for surgery may be substituted | |
| Extra Fine Bonn Scissors, 8.5cm, straight tip, cutting edge 13mm | Fine Science Tools | 14084-08 | ||
| Eye Dressing Forceps, 10cm, tip width 0.5mm, curved | Fine Science Tools | 11152-10 | ||
| Dumont #5/45 Forceps- Dumoxel Standard Tip, 11cm, angled | Fine Science Tools | 11251-35 | Extra-fine tipped forceps for performing craniotomy | |
| Standard Pattern Forceps, straight, 2.5mmx1.35mmtip, 12cm | Fine Science Tools | 11000-12 | ||
| Microtorque Control Box and Tech2000 handpiece | Ram Products, Inc. | TECH2000ON/OFF | Dental drill | |
| Micro Drill Stainless Steel Burrs 1.4mm tip diameter | Fine Science Tools | 19008-14 | ||
| Wiretrol micropipettes, to deliver 1-5 Ul | VWR International/ Drummond | 5-000-1001 or 53480-287 | ||
| Mineral oil | VWR International | 29447-338 | ||
| Manual Micromanipulator and Tilting Base (right-handed) | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3-R | Used for determining stereotaxic co-ordinates | |
| UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | ||
| Sutures | VWR International | 95056-952 | ||
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | ||
| Tobradex | Available from your institution’s veterinary services |
References
- Kaplitt, M. G., Leone, P., Samulski, R. J., Xiao, X., Pfaff, D. W., O’Malley, K. L., During, M. J. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nat Genet. 8, 148-154 (1994).
- Harding, T. C., Dickinson, P. J., Roberts, B. N., Yendluri, S., Gonzalez-Edick, M., Lecouteur, R. A., Jooss, K. U. Enhanced gene transfer efficiency in the murine striatum and an orthotopic glioblastoma tumor model, using AAV-7- and AAV-8-pseudotyped vectors. Hum Gene Ther. 17, 807-820 (2006).
- Lo, W. D., Qu, G., Sferra, T. J., Clark, R., Chen, R., Johnson, P. R. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to the brain: duration and modulation of expression. Hum Gene Ther. 10, 201-213 (1999).
- Lowery, R. L., Zhang, Y., Kelly, E. A., Lamantia, C. E., Harvey, B. K., Majewska, A. K. Rapid long-term labeling of cells in the developing and adult rodent visual cortex using double-stranded adeno-associated viral vectors. Dev Neurobiol. 69, 674-688 (2009).
